论文部分内容阅读
那可丁通过抑制HIF-1α提高低氧卵巢癌细胞化疗敏感性低氧是众多实体肿瘤生长到一定程度时所具备的共同特征,而核转录因子HIF-1（低氧诱导因子-1）是低氧条件下调节细胞代谢以介导肿瘤生存的关键因子,它通过调控下游60多种肿瘤生存相关靶基因的表达促进肿瘤进展,与实体肿瘤的血管生成、侵袭转移、放化疗耐受等恶性生物学行为密切关联。HIF-1α是HIF-1的关键调控亚基,在70%实体瘤高表达并与肿瘤放、化疗敏感性密切相关。卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,尽管肿瘤细胞减灭术联合以紫杉醇+铂类药物为主的术前辅助化疗及术后化、放疗等综合治疗模式已大大延长了卵巢癌患者的生存时间,但其五年生存率仍停滞在30%左右,究其原因,除了患者就诊时多为中晚期以外,化疗耐药尤其是多药耐药是导致患者复发及最终广泛转移的主要原因。HIF-1α在卵巢癌有较高表达,我们由此猜测HIF-1α是导致卵巢癌化疗敏感性下降的重要因素。本研究以人卵巢癌细胞株C13K为研究对象,检测常氧及低氧条件下小分子化合物那可丁对其化疗敏感性的影响,并在mRNA水平和蛋白水平探讨那可丁对HIF-1α的调控机制,通过检测HIF-1α定位、转染HIF-1α荧光报告质粒、检测HIF-1下游靶基因的mRNA表达来研究那可丁对HIF-1转录活性的影响,为将那可丁用于以HIF-1α为靶点的卵巢癌辅助化疗提供了实验依据。第一部分低氧对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响目的探讨低氧对卵巢癌细胞株C13K化疗敏感性的影响。方法低氧诱导剂CoCl2处理C13K细胞,台盼蓝排除实验检测细胞存活率、western blotting检测HIF-1α蛋白表达水平以确认是否成功建立“有效低氧”。之后,C13K细胞分为常氧组和低氧组,梯度浓度顺铂作用后,MTT法检测细胞增殖情况。结果CoCl2提高C13K细胞HIF-1α蛋白表达水平且对细胞存活率无明显影响;顺铂显著抑制C13K细胞增殖能力（P<0.05）且该效应具有浓度依赖性和时间依赖性,该效应在常氧组较在低氧组显著（P<0.05）。结论人卵巢癌细胞C13K的“有效低氧”成功建立;低氧能降低人卵巢癌细胞C13K对顺铂的化疗敏感性。第二部分那可丁对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响目的检测那可丁对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响。方法常氧和低氧培养的C13K细胞各分为四组:对照组,那可丁组,顺铂组,那可丁/顺铂组,台盼蓝排除实验检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果低氧条件下那可丁/顺铂组细胞死亡率及凋亡率均显著高于顺铂组（P<0.05）,常氧条件下那可丁/顺铂组与顺铂组细胞死亡率及凋亡率无明显差别。结论那可丁提高低氧卵巢癌细胞C13K对顺铂的化疗敏感性。第三部分那可丁对HIF-1α的抑制作用目的检测常氧和低氧条件下那可丁对人卵巢癌细胞C13K中HIF-1α表达和HIF-1转录活性的影响。方法C13K细胞分常氧组对照组、常氧那可丁组、低氧组对照组、低氧那可丁组,采用RT-PCR、western blotting、免疫荧光分别检测各组细胞HIF-1α、MDR1、Bax的mRNA表达、HIF-1α蛋白表达和HIF-1α细胞内表达定位情况;低氧对照组、低氧那可丁组C13K细胞均用放线菌酮作用梯度时间后,western blotting检测细胞HIF-1α蛋白表达水平;低氧培养C13K细胞,分四组（对照组,那可丁组,MG132组,那可丁+MG132组）处理后,western blotting检测各组细胞HIF-1α蛋白表达水平;HIF-1的荧光报告质粒pGL3-VEGF-HRE和阴性对照质粒pGL-Promoter vector转染C13K细胞,分常氧对照组、常氧那可丁组、低氧对照组、低氧那可丁组处理所需时间后,检测各组细胞荧光素酶活性。结果:那可丁对HIF-1αmRNA水平无明显影响,但那可丁能通过缩短HIF-1α半衰期明显降低其蛋白水平,该抑制效应可被MG132阻断;那可丁抑制低氧诱导的HIF-1α核转位、HIF-1α报告质粒的荧光素酶活性升高及HIF-1靶基因MDR1 mRNA水平的提高,那可丁提高低氧条件下HIF-1靶基因Bax mRNA水平。结论那可丁通过蛋白酶体途径加速降解HIF-1α从而抑制其蛋白表达水平,进而抑制HIF-1转录活性。