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嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）是一种具有降解木质纤维素能力的嗜热真菌,其最适生长温度是45℃。目前,嗜热毁丝霉基因组已于2011年测序完成并公布。来自嗜热毁丝霉的一些降解酶在70℃-80℃的高温条件下仍可保持稳定活性。因而,嗜热毁丝霉被认为是一个潜在的中高温酶库。表观遗传是指在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,使基因表达发生可遗传变化的现象。表观遗传机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑以及非编码RNA的调控等。表观遗传修饰虽然不会引起DNA序列的改变但是它可以影响基因的表达,对器官的发育和个体的生长具有重要的影响。DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰方式之一,主要通过DNA甲基转移酶使DNA发生甲基化。在动物细胞中DNA的甲基化可发生在启动子、转座子、增强子、沉默子和基因本体等多个部位;DNA甲基转移酶DNMT1是细胞中最重要的甲基转移酶,具有从头和维持甲基化的功能,有研究表明干扰该基因的表达将会降低一些基因的甲基化状态从而增加部分基因的表达量。而在植物和丝状真菌中,DNA甲基转移酶使基因组的转座子和重复序列发生甲基化。此外,在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）发现的蛋白甲基转移酶LaeA是一种广泛的调节因子,有修饰异染色质结构的作用,并以此调节多种基因的表达。本文主要利用RNAi技术分别干扰嗜热毁丝霉Mtdnmtl及Mtlae基因的表达,以探究真菌表观遗传机制对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响及对相关纤维素酶基因的表达调控作用。本论文主要研究内容及结果如下:（1）RNA干扰嗜热毁丝霉Mtdnmtl基因方面:Mtdnmtl基因的编码蛋白在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中同源性最高的同源蛋白是胞嘧啶C5位点的DNA甲基转移酶。本研究构建了Mtdnmtl基因干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtdnmtl,通过嗜热毁丝霉原生质体转化法,将pUC19-siRNA-Mtdnmtl与pAN7-1共同导入嗜热毁丝霉受体细胞中,在含潮霉素B的抗性平板上筛选,再通过RT-qPCR技术筛选,获得一个干扰效率达75%的转化子D1进行后续实验。对转化子D1在不同碳源诱导条件下的滤纸酶（FPA）、内切酶（CMC）、纤维二糖水解酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BG）活性进行测定,发现在2%微晶纤维素诱导条件下,滤纸酶活和CMC酶活均在第五天达到最高值,分别是野生型（WT）的1.17倍和1.04倍,BG酶活和CBH酶活均在第六天达到最高,分别是是野生型的1.13倍和1.16倍;在5%α-乳糖诱导条件下,CMC酶活相比2%微晶纤维素诱导下表现相对较强的活性,在第三天达到最高值,转化子D1酶活是野生型的1.18倍,而CBH酶活活性极低。通过实时荧光定量PCR技术对主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1、egl3、bgl1及相关调控基因xyr1和cre1分析发现,在2%微晶纤维素诱导条件下,xyr1、碳代谢阻遏因子cre1表达量均低于野生型,而主要纤维素酶基因表达量均不同程度高于野生型,而在5%α-乳糖诱导条件下,转化子D1的主要纤维素酶基因及相关因子表达量均高于野生型。（2）RNA干扰嗜热毁丝霉Mtlae基因方面:Mtlae基因编码蛋白在里氏木霉（Trire2:41617）以及构巢曲霉中得到最高同源性的蛋白分别是蛋白甲基转移酶LAE1和LAEA。同样,构建Mtlae基因干扰表达载体pUC19-siRNA-Mtlae,利用原生质体转化法将pUC 19-siRNA-Mtlae与pAN7-1共同导入嗜热毁丝霉受体细胞中,经潮霉素B抗性平板筛选,得到一个干扰效率为73%的转化子S33进行后续实验。分别测定转化子S33在2%微晶纤维素和5%α-乳糖两种不同碳源诱导条件下的滤纸酶（FPA）、内切酶（CMC）、纤维二糖水解酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BG）活性进行测定。在2%微晶纤维素诱导条件下,转化子S33滤纸酶活和CMC酶活同样在第五天达到最高值,分别是野生型（WT）的1.33倍和1.15倍,BG和CBH酶活在第六天达到最高,分别是野生型的1.17倍和1.20倍;而在5%α-乳糖诱导条件下,转化子S33酶活均比野生型低,滤纸酶活从第2天开始下降到第5天几乎没有酶活,第二天转化子酶活是野生型的80%。同样,CMC酶活在α-乳糖诱导下表现相对较强的活性,但转化子CMC酶活从第二天开始呈下降趋势,在第三天野生型达到最高值,转化子酶活是野生型的64%。通过实时荧光定量PCR技术对S33主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1、egl3、bgl1及相关调控基因xyr1和cre1分析发现,在2%微晶纤维素诱导条件下,除xyr1表达量稍低于野生型外,cbh1、cbh2、egl1、egl3、bgl1及碳代谢阻遏因子cre1表达量均高于野生型,而在5%α-乳糖诱导条件下,第2天转化子S33的主要纤维素酶基因cbh2、egl1、egl3、bgl1表达量均比野生型低,而xyr1、碳代谢阻遏因子cre1则稍高于野生型,纤维素酶基因表达与酶活结果表现基本一致。综上所述,不同诱导物对嗜热毁丝霉纤维素酶活性作用有较大区别。尽管xyr1被证实在多种丝状真菌中充当纤维素酶转录激活因子,但其对嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达基本不起作用。对嗜热毁丝霉Mtdnmtl基因进行干扰后,无论是2%微晶纤维素诱导还是5%α-乳糖诱导,转化子D1各纤维素酶活性均表现出明显高于野生型,纤维素酶基因表达也呈相应趋势。这表明DNA甲基化是影响纤维素酶基因表达的重要因素,通过干扰DNA甲基化可在一定程度上提高纤维素酶的活性。对嗜热毁丝霉Mtlae基因进行干扰则发现,在2%微晶纤维素诱导条件下,转化子S33四种纤维素酶活性均高于野生型,而在5%α-乳糖诱导条件下则呈相反结果,这表明蛋白甲基转移酶对纤维素酶活性的调节作用受不同诱导物的影响。