【摘 要】
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目的正畸力能够通过牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）实现对牙槽骨的改建。如何调控PDLSCs在正畸牙移动过程中的骨改建功能是一个关键的科学问题。本研究旨在探究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）Hedgehog相互作用蛋白反义 RNA1（Hedgehog interacting protein antis
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.81970964，No.81771108）；
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目的正畸力能够通过牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）实现对牙槽骨的改建。如何调控PDLSCs在正畸牙移动过程中的骨改建功能是一个关键的科学问题。本研究旨在探究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）Hedgehog相互作用蛋白反义 RNA1（Hedgehog interacting protein antisense RNA 1,HHIP-AS1）在压力条件下的表达,HHIP-AS1对PDLSCs成骨分化和迁移趋化能力的影响以及相关调控机制。材料方法1.分离、培养人PDLSCs。利用流式细胞仪检测PDLSCs间充质干细胞表面标志物的表达情况。2.利用圆形玻璃片对PDLSCs施加持续压力,显微镜下观察细胞形态,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR）检测HHIP-AS1在压力条件下的表达。3.通过慢病毒转染方法对PDLSCs进行HHIP-AS1基因的敲低和过表达,利用real-time RT-PCR 测定转染效率。4.对HHIP-AS1敲低和过表达的PDLSCs进行成骨诱导,通过碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色、Ca2+浓度定量检测,以及通过利用Western blot检测成骨分化标志物骨涎蛋白（bonesialoprotein,BSP）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）及成骨相关转录因子（osterix,OSX）的表达,评估成骨分化能力。5.对HHIP-AS1敲低和过表达的PDLSCs进行划痕迁移实验和Transwell趋化实验,并进行定量分析,评估迁移趋化能力。6.对 HHIP-AS1 敲低的 PDLSCs 进行 RNA 测序（RNA sequencing,RNA-seq）,通过生物信息学分析检测下游基因、生物学功能、关键通路。结果1.实验培养的PDLSCs,CD90表达阳性,CD34和CD45表达阴性。2.PDLSCs受到2、4、6小时的持续压力时,细胞形态发生改变,HHIP-AS1的表达随时间持续下降。3.HHIP-AS1在PDLSCs中被有效敲低或过表达。HHIP-AS1增强PDLSCs的碱性磷酸酶活性和体外矿化,促进成骨分化标志物BSP、OCN和关键转录因子OSX在蛋白水平的表达。4.划痕后24小时和48小时,HHIP-AS1抑制PDLSCs的迁移能力。PDLSCs加入Transwell小室后48小时,HHIP-AS1抑制PDLSCs的趋化能力。5.RNA-seq检测到在HHIP-AS1敲低的PDLSCs中差异表达的mRNA,包括:ROR2、CXCL12、FGF5,差异表达的lncRNA,包括:NEAT1、LINC00973。在2小时持续压力条件下,ROR2、CXCL12表达升高,FGF5表达降低。通过生物信息学分析获得重要的生物学功能和关键通路,包括:PI3K/Akt信号通路和JAK-STAT信号通路。结论1.在压力条件下,HHIP-AS1在PDLSCs中的表达下降。2.HHIP-AS1促进PDLSCs的成骨分化能力,抑制PDLSCs的迁移趋化能力。3.HHIP-AS1可能成为正畸治疗中加速牙齿移动的候选靶点。
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