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研究背景：肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤,也是全球三大肿瘤死因之一。POLD1是DNA聚合酶δ催化亚基P125的编码基因。P125在细胞周期的S期与增殖细胞核抗原(PCNA)和复制因子C(RFC)的参与下形成复合物定位于复制叉,以前导链和后续链为模板两种不同形式的DNA复制,为细胞的增殖提供物质基础。研究发现POLD1基因在某些肿瘤细胞系中高表达,并具有促进细胞恶性增殖,增强细胞侵袭力的作用。近年来有研究表明,细胞的增殖依赖POLD1编码的P125参与合成复制DNA,且这个过程与细胞周期调控密不可分。调控细胞周期的核心因子是细胞周期蛋白依赖性激酶,它与不同的细胞周期蛋白形成多种复合物,作用于细胞周期的不同时相,决定着细胞周期的进程。其中CDK4/cyclinD的复合物就是调控G1/S期的关键蛋白复合物,它可以使Rb蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基发生磷酸化。在通常情况下Rb蛋白处于低磷酸化状态,并与转录因子E2F结合。磷酸化后的Rb蛋白可导致E2F的释放,释放出的E2F可以诱导cyclin E的表达, cyclin E与CDK2蛋白形成复合物后又可以使Rb蛋白发生磷酸化,使E2F与cyclin E的活性在G1/S期交界点处迅速增高,引起一系列与G1/S期行进有关的靶分子的表达,调控细胞完成DNA复制。近来的研究结果显示,CDK4基因在多种恶性肿瘤组织和细胞中都存在表达异常,包括核苷酸序列位点的缺失和(或)插入、替换,基因表达表达丰度的改变等。作为POLD1基因上游的细胞周期关键因子,CDK4调控POLD1通路及机制对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义,对此深入的研究有利于肿瘤的诊断、治疗及预后判断。目的：检测P125在HCC中的表达；检测CDK4和POLD1在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达相关性；探讨CDK4对POLD1/P125表达的调控及其意义。方法：1.免疫组织化学：采用广西医科大学一附院2011年4月-2011年7月期间经病理确诊的HCC患者47例,取其肝癌组织及其癌旁组织(距肿瘤2cm以上),15例肝内胆管结石旁肝组织作为正常对照。采用免疫组织化学方法检测P125蛋白在肝癌、癌旁及正常组织中的表达情况,分析P125蛋白与HCC临床病理特征的关系。2.质粒构建：设计人CDK4基因全长特异性引物进行PCR扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以真核表达载体pEGFP-C1为模板酶切后连接,获得重组质粒GFP-CDK4。3.细胞转染：A：瞬时转染：将转染试剂lipo2000与质粒以1：2比例混合,(转染质粒GFP-CDK4为实验组,转染pEGFP-C1为阴性对照组,未经处理的SMMC-7721为空白对照组)。室温孵育15min后均匀滴入培养板细胞,6h后换用完全培养基,48h收取细胞。B：稳定转染：将瞬时转染5天后的6孔板细胞,在每个孔加入终浓度为500μg/ml的G418进行筛选,3周后得到稳定转染的细胞。4.MTT：将方法3中稳定转染SMMC-7702种植于96孔板中,种板后的24、48、72、96h分别采用MTT法检测实验组和对照组细胞,绘制生长曲线。5.实时荧光定量PCR (qRT-PCR):用Trizol提取方法3中瞬时转染的实验组和对照组细胞总RNA,逆转录为cDNA后,以此为模板,采用比较△ΔCt法,Real Master Mix(SYBR Green),设置β-actin为内参,检测CDK4与POLD1以及其他相关细胞周期因子的表达,结果用ABI7500Software v2.0.5分析数据。6.蛋白质印迹(Western blot):用Western blot检测方法3中稳定转染的实验组和对照组中CDK4和P125蛋白的表达量,设置β-actin为内参,结果用LI-COR Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描,Odyssey V3.0软件分析图像及数据。7.生物信息学分析POLD1启动子结合位点：使用当今主流权威的转录因子结合位点在线预测软件www.gene-regulation.com/pub/databases.html#transfac和www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html预测POLD1基因启动子上的结合位点,发现并初步筛选出与CDK4/POLD1通路相关的目标因子。结果：1.免疫组化检测P125蛋白在肝癌中的阳性率为93.6%(44/47),明显高于癌旁10.6%(5/47)及正常肝组织6.6%(1/15)。三组比较有显著差异(P<0.01),其中,P125蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01)。癌旁组织与正常组织比较,差异无统计学意义(P>0.05)。P125蛋白在肝癌组织中的阳性表达率与肿瘤大小、肿瘤组织Ki67的表达、HBV感染、AFP水平、肝内外转移以及是否伴有肝硬化无明显相关(P>0.05,),但是与肝癌组织的分化程度有统计学意义(P<0.01)。2.成功构建人CDK4绿色荧光真核表达重组质粒GFP-CDK4。经过测序比对后发现SMMC-7721细胞中的CDK4为突变型基因,存在碱基的突变和缺失。GFP-CDK4转染到SMMZ-7702中后GFP蛋白和CDK4同时表达,瞬时转染和稳定转染后的细胞都可以观察到细胞内出现绿色荧光。3.MTT分析实验组SMMC-7702细胞与转染PEGFP-C1对照组细胞SMMC-7702和空白对照组SMMC-7702细胞相比,吸光度值OD490在种板后的24h差异无统计学意义(P>0.05),但在48h、72h和96h差异具有统计学意义,(P<0.05),实验组细胞增殖速度显著高于对照组和空白对照组。4. qRT-PCR在mRNA水平证实了实验组细胞7702在转染GFP-CDK4后的12h后CDK4相对表达量升高并持续高表达,POLD1在转染后的24h和48h的相对表达量明显高于12h(P<0.01),说明POLD1的表达相对于CDK4存在表达时间滞后效应；在转染后48h实验组CDK4和POLD1的相对表达量则明显高于对照组,阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。5. Western blot分析实验组cdk4蛋白相对于对照组和空白对照组高表达P<0.05),对应的P125蛋白的表达增高,与对照组和空白对照组差异明显(P<0.05),对照组和空白对照组间则没有明显差异(P>0.05),结果具有统计学意义。即cdk4高表达可以促进P125的高表达,结论与mRNA水平趋势一致。6.生物信息学软件预测POLD1启动子上没有直接和CDK4结合的位点,但是我们发现有某些结合位点存在于POLD1的启动子序列上的因子其启动子上存在CDK4的结合位点。我们推测CDK4可能是通过其他因子间接调控POLD1的表达。结论：1.P125蛋白在肝癌组织中呈较高表达,且与肝癌等级密切正相关,但与Ki67无明显相关性,提示P125在肝癌的发生和发展中不仅起到合成DNA的作用,而且可能还担负肝细胞癌相关其他已知或未知的作用。2.细胞系试验中证实了CDK4高表达促进了POLD1/P125在mRNA和蛋白质水平的高表达,从而促进了细胞的增殖；验证了POLD1作为CDK4的下游基因受到CDK4的调控。