论文部分内容阅读
目的:研究天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)对食管癌细胞Eca-109增殖的影响及与survivin的关系,在此基础上,进一步探讨Survivin反义寡核苷酸联合TCS诱导细胞凋亡的作用及其分子机制。方法: TCS处理食管癌细胞Eca-109后,应用MTT法检测TCS对Eca-109细胞增殖的抑制作用;透射电子显微镜观察亚细胞结构变化;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡率;流式细胞仪分析细胞周期;RT-PCR检测Eca-109细胞survivin mRNA表达变化;Western blot检测Survivin、Caspase-3与C-myc蛋白表达变化;TRAP-PCR银染法测定细胞的端粒酶活性。进而,将实验分6组:未处理组、脂质体组、survivin正义寡核苷酸组(SODN)、survivin反义寡核苷酸组(ASODN)、天花粉蛋白组(TCS)、survivin反义寡核苷酸联合天花粉蛋白组。各处理因素作用食管癌细胞Eca-109后, RT-PCR检测Eca-109细胞survivin mRNA表达变化;Western blot检测Survivin、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达变化;AnnexinV-FITC/PI双染法检测Eca-109细胞早期凋亡率。结果:TCS对食管癌细胞Eca-109增殖有抑制作用且具有剂量-时间依赖性;33μg/ml TCS作用细胞48h后,与未处理组相比,TCS组早期凋亡率增高(P<0.05),G2期阻滞、S期细胞明显增多(P<0.05),survivin mRNA及Survivin、C-myc蛋白表达量下降,Caspase-3蛋白表达量则增高,端粒酶活性降低,差别均具有统计学意义(P<0.05)。各处理因素作用食管癌细胞Eca-109 48h后, ASODN组、TCS组和联合组的survivin mRNA和Survivin蛋白表达水平明显低于脂质体组、SODN组和未处理组,差别具有显著性(P<0.05);脂质体组、SODN组和未处理组两两比较,差别均无显著性(p>0.05);联合组survivin mRNA和Survivin蛋白表达水平明显低于ASODN组和TCS组,差别有显著性(P<0.05);ASODN组和TCS组差别无显著性(P>0.05)。ASODN组、TCS组和联合组的早期凋亡率和Caspase-3蛋白表达水平明显高于脂质体组、SODN组和未处理组,差别具有显著性(P<0.05);脂质体组、SODN组和未处理组两两比较,差别均无显著性(P>0.05);联合组的早期凋亡率和Caspase-3蛋白表达水平高于ASODN组和TCS组,差别有显著性(P<0.05);ASODN组和TCS组差别无显著性(P>0.05)。TCS组和联合组细胞的Bcl-2蛋白的表达,与其他四组相比,明显降低,差别有显著性(P<0.05), Bax蛋白的表达则增加,差别也具有显著性(P<0.05)。关于Bcl-2、Bax蛋白的表达,TCS组和联合组差别无显著性(P>0.05),脂质体组、SODN组、ASODN组与未处理组两两比较,差别均无显著性(P>0.05)。结论:TCS具有抑制食管癌细胞Eca-109增殖、诱导凋亡作用, survivin抑制可能是其作用机制的关键环节。TCS联合survivin的ASODN在诱导Eca-109细胞的凋亡方面,能够发挥协同作用;TCS和survivin的ASODN共同抑制survivin基因表达;TCS下调Bcl-2蛋白表达和上调Bax蛋白表达,激活caspase级联反应途径,此为两药发挥协同作用的分子基础。