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鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH),是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的雏鸭的一种高度致死,传播迅速的传染病,是危害养鸭业最严重的疫病之一。鸭肝炎病毒可分为3个血清型:血清1型鸭肝炎病毒((鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV),DHAV 又分为 DHAV-A、B、C 或(称 DHAV-1、2、3)3 个基因型)、血清2型鸭肝炎病毒(又称为鸭星状病毒1型(Duck astrovirus 1,DAstV-1))、血清3型鸭肝炎病毒(又称为鸭星状病毒2型(Duck astrovirus 2,DAstV-2))。目前我国的鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的,且常出现两种亚型的混合感染,DHAV-3已代替DHAV-1成为优势血清型,这也许是许多鸭场已经接种了传统DHAV-1疫苗,却仍暴发鸭肝炎的原因之一。目前市面上还未出现针对DHAV-3的商品化疫苗,研发出能针对DHAV-3的诊断和防治的生物制剂具有重要意义。VP1蛋白作为DHAV的主要衣壳蛋白,含有主要保护性抗原位点,能刺激产生特异性保护受体,且VP1基因也是DHAV基因组的高变区,具有最大遗传多样性,决定了不同毒株的分子特征。因此,为进一步了解鸭甲肝病毒的病原学特征,研制出诊断和防治DHAV-3的生物制品,本研究分离鉴定了 8株DHAV-1和14株DHAV-3病毒,对其VP1基因序列进行测定和分析,并以DHAV-3分离株的VP1基因为模板分别进行了真核和原核表达,以纯化的原核表达蛋白为抗原,初步建立了检测DHAV-3抗体的ELISA方法,对真核表达作为DNA疫苗候选生物材料的可能性进行了初步评价。本研究主要分为三部分:1、22株鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因的分子特征分析对2017～2019年从山东省采集的27份疑似感染鸭肝炎病毒的病料进行了分离、鉴定,并对分离株的VP1基因进行了序列测定以及遗传变异分析。结果表明,27份疑似病料接种鸡胚进行病毒分离,共分离出了 22株病毒,8株为DHAV-1,14株为DHAV-3。VP1基因序列比对结果显示:8株DHAV-1分离株与15株参考株的核苷酸同源性为91.7%～98.6%,氨基酸同源性为93.7%～97.5%。8株DHAV-1分离株之间的核苷酸同源性为97.2%～1 00%,氨基酸同源性为97.9%～100%;14株DHAV-3分离株与17株参考株的核苷酸同源性为89.4%～98.9%,氨基酸同源性为92.1%～100%。14株DHAV-3分离株之间的核苷酸同源性为93.9%～100%,氨基酸同源性为96.7%～100%,属于Ⅰ型(GI型)。2、鸭甲肝病毒3型VP1基因的真核表达设计了三对引物(其中一对引物含有Kozak序列)分别RT-PCR扩增DHAV-3分离株的VP1基因,插入不同的真核载体,构建出了重组质粒pcDNA3.1-3-VP1,KpcDNA3.1-3-VP1和pCAGGS-3-VP1,并将其转染Vero细胞,表达产物经间接免疫荧光和WB鉴定。结果表明:VP1基因在pcDNA3.1和pCAGGS中均获得表达,表达的重组蛋白大小为27kDa,与预期相符。进一步将重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠,每种质粒免疫5只BALB/c小鼠,并用空载体设置阴性对照,每只100 μg,2周免疫一次,共免疫3次。三免后14天取血清采用间接ELISA方法检测小鼠体内抗体水平,结果显示:小鼠三免后14天能够检测到抗体,而对照组未检测到特异性抗体,表明本实验构建的真核重组质粒能够诱导小鼠产生特异性抗体。3、鸭甲肝病毒3型VP1基因的原核表达以及抗体检测ELISA方法的初步建立RT-PCR扩增DHAV-3分离株的VP1基因,插入原核表达载体,构建了带有His标签的重组质粒PET-32a-3-VP1,并将其转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳鉴定,出现了 40.8kDa大小的表达产物条带,与预期相符。结果表明:重组质粒PET-32a-3-VP1构建成功,能在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中表达。随后利用His-标签蛋白纯化柱对原核表达的VP1重组蛋白进行纯化,将其作为检测抗原,建立ELISA方法,优化了反应条件:最佳抗原包被浓度为4.28μg/mL,最佳血清浓度为1:20,最佳酶标二抗浓度为1:400,最佳包被条件为4℃过夜,最佳封闭时间为90min,最佳酶标二抗时间为90min,最佳显色时间为15min,该方法具有较高的重复性和特异性,这些结果为和DHAV-3抗体的检测奠定了基础。