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Harpins是由革兰氏阴性茵产生的一种多效应蛋白质。其中HrpNEa研究比较透彻,早期实验表明外施HrpNEa能诱导植物包括抗虫性在内的多种抗性。研究发现HrpNEa诱导后能抑制拟南芥韧皮部取食昆虫—桃蚜(Myzus persicae)勺繁殖。桃蚜取食拟南芥韧皮部后,能激活乙烯信号通路并且诱导韧皮部防卫反应相关的基因的表达,引发植物韧皮部防卫反应(Phloem-based defenses, PBD)。 PBD能够抵御刺吸式昆虫的取食。韧皮部防卫反应包括韧皮部蛋白的积累、p-1,3-葡聚糖胼胝质的生物合成、筛孔的缩小和筛板的增厚。本论文研究的主要目的是阐明在HrpNEa诱导拟南芥抗虫过程中起作用的转录因子并研究其转录调控机制；解析HrpNEa诱导抗虫时启动的韧皮部防卫机制,寻找韧皮部防卫通路中的作用因子,并研究各因子之间的调控关系。1. HrpNEa诱导拟南芥抗虫过程中的转录因子筛选Harpin蛋白质可以通过激活乙烯信号通路进而诱导拟南芥的抗虫作用。EIN2,是乙烯信号通路的关键调控因子,在植物的防卫反应中有重要作用。为了研究HrpNEa在诱导拟南芥抗虫中的转录调控机制,我们从拟南芥中挑选了乙烯或者昆虫相关的37个的转录因子,分析这37种转录因子在拟南芥抗虫过程中的作用。RT-PCR方法显示37种转录因子中22种转录因子的编码基因能被乙烯与HrpNEa诱导上调表达,6种下调表达,其余9种没有变化。诱导上调表达基因中AtMYB44上调表达程度最强。根据对37种转录因子突变体的蚜虫繁殖率和趋避实验结果分析,发现与野生型相比HrpNEa处理后9种突变体抗虫能力较强,4种突变体较弱,24种突变体没有显著变化；所有突变体中atmyb44的抗虫能力是最弱的。进一步的研究发现乙烯信号通路的标志基因PDF1.2在突变体atmyb44没有表达,说明这个突变体中乙烯信号通路被阻断,并且atmyb44中EIN2基因没有被诱导表达。以上结果显示AtMYB44在HrpNEa诱导拟南芥抗桃蚜的过程中有调控乙烯信号通路的作用。2. AtGSL5与AtMYB44在HrpNEa诱导拟南芥抗虫过程中的作用HrpNEa处理拟南芥后可以诱导AtMYB44的表达量增加,提高拟南芥对桃蚜的抗性。在植物受到韧皮部取食昆虫如桃蚜的侵害时,部分葡聚糖合酶基因(GLUCAN SYNTHASE-LIKE,GSL)及其作用产物p-1,3-葡聚糖胼胝质起了重要作用。为了阐明GSL在HrpNEa诱导抗虫中的作用,选用AtGSLl到AtGSL12这12个葡聚糖合酶基因发生突变的37个atgsl突变体为材料。结果发现在37个atgsl突变体的抗虫性普遍比野生型差,其中atgsl5和atgsl6抗虫能力最差。刺探电位图谱技术(electrical penetration graph technique, EPG)的实验结果表明在HrpNEa处理atgsl突变体后atgsl5的抗虫能力是最弱的,这些结果都说明AtGSL5在HrpNEa诱导拟南芥抗虫过程中的重要作用。除北之外,HrpNEa处理野生型植株Clo-0后AtGSL5转录水平增强,胼胝质的积累量增加,但处理突变体atgsl5后没有发现上述的变化。我们还发现在突变体atgsl5和atmyb44中AtGSL5的表达量和胼胝质的积累量都非常低。由此可知AtGSL5和AtMYB44在HrpNEa诱导拟南芥抗桃蚜过程中都起了重要作用。3. HrpNEa诱导拟南芥抗桃蚜过程中AtPP2-A1的作用HrpNEa能够诱导拟南芥产生抗桃蚜等韧皮部取食昆虫的能力。当植物受到韧皮部取食昆虫侵袭时,就会启动韧皮部防卫反应来抵御侵害。韧皮部蛋白(PP2)是植物韧皮部的重要组成部分之一。通过筛选我们发现拟南芥的30个AtPP2基因中AtPP2-A1的抗虫作用显著。因此,我们将目标放在研究PP2编码基因AtPP2-A1在HrpNEa诱导植物抗虫中的作用机制上。EPG (electrical penetration graph)技术和蚜虫趋避实验结果发现,HrpNEa能诱导拟南芥野生型WT(wild type) Col-0产生抗虫性,在AtPP2-A1突变体atpp2-al上却不能诱导产生抗性。与突变体表现相反,AtPP2-A1过表达植株PP2OETAt (AtPP2-A1-overexpression transgenic Arabidopsis thaliana)表现出更强的抗性。我们对过表达植株PP2OETAt进行了AtPP2-A1定位的检测,发现基因在植株的叶片、花与茎等器官上都有表达。在这些器官上观察到PP2OETAt表现出比野生型更强的抗虫能力。这些结果说明AtPP2-A1在HrpNEa在诱导拟南芥产生抗虫性中具有重要作用。4. AtMYB44通过EIN2调控拟南芥对于桃蚜与小菜蛾的抗性EIN2是乙烯信号通路中的重要调控因子,同时也在植物的抗虫过程中起作用。拟南芥转录激活因子AtMYB44能够调节EIN2的表达水平。为了研究AtMYB44对EIN2的调节作用与拟南芥抗虫的关系,我们利用了多种植物材料,其中主要有：拟南芥野生型Col-0(wild type, WT).突变体atmyb44、atmyb44的回补体(Complemented atmyb44, Catmyb44)、AtMYB44过表达植株(AtMYB44-Overexpression Transgenic Arabidopsis)和MYB44OTA ein2-1(MYB44OTA与EIN2突变体ein2-1杂交产生)。结果发现AtMYB44在拟南芥抗桃蚜和小菜蛾的过程中起重要作用。不论是MYB44OTA还是蚜虫诱导的Catmyb44都会导致植株体内AtMYB44蛋白的表达量增加,而植株的抗性水平随之增加。在MYB44OTA中AtMYB44与EIN2的结合能力要强于Catmyb44。但在MYB44OTA ein2-1中没有发现AtMYB44与EIN2结合的情况。在上述的几种植物材料中,只有过表达植株MYB44OTA,表现出持续的对于桃蚜等韧皮部取食昆虫的抗性和体内芥子油苷合成相关基因的大量表达。在MYB44OTA ein2-1与ein2-1中不存在芥子油苷合成基因表达和韧皮部防卫反应现象。这就建立了AtMYB44在促进EIN2表达与增强拟南芥抗虫性之间的遗传学关系,推测AtMYB44是通过调节依赖于EIN2的韧皮部防卫反应进而调控拟南芥的抗虫性。