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背景和目的利托那韦（RTV,用于治疗HIV感染）和利福平（RIF,抗结核病药物）联合应用致肝损伤发生的风险高达100%。RIF是人类孕烷X受体（PXR）的激活剂,也是细胞色素P450 3A4（CYP3A4）的强诱导剂,而CYP3A4在RTV的生物活化中发挥重要作用。因此,PXR激活诱导CYP3A4过度表达可能是导致RTV肝损伤的重要原因。长链非编码RNA（lnc RNAs）对CYPs的调控至关重要。课题组前期研究发现,肝细胞核转录因子4A（HNF4A）反义RNA 1（HNF4A-AS1）负向调控肝细胞中PXR和CYP3A4的表达。但HNF4A-AS1是否通过HNF4A调控PXR/CYP3A4的表达而影响RTV所致肝毒性目前尚不清楚。本研究拟探讨:（1）PXR激活在RTV致小鼠肝损伤中的作用;（2）HNF4A-AS1在RTV致肝损伤中的作用及调控HNF4A/PXR/CYP3A4表达的机制;（3）验证Hnf4aos在RTV致小鼠肝损伤中的作用。鉴于PXR激活存在明显的种属差异,在人肝细胞和小鼠实验中分别以RIF和孕烯醇酮16α-腈（PCN）代表PXR的典型激活剂,观察PXR激活对RTV肝损伤的作用。该研究将拓展PXR介导代谢性药物相互作用的研究领域,为药源性肝损伤的防治提供新策略。实验方法1.Pxr激活在RTV致小鼠肝损伤中的作用本部分实验以野生型（WT）和Pxr敲除型(Pxr-/-)C57BL/6小鼠为模型动物,探讨Pxr激活在RTV致小鼠肝损伤中的作用。将WT小鼠随机分为四组:阴性对照（NC）组、PCN组、RTV组和PCN+RTV组（n=6/组）。NC组以玉米油（溶媒对照,10 m L/kg,qd,i.p.）连续处理4天;PCN组以PCN（100 mg/kg,qd,i.p.）连续处理4天;RTV组以玉米油（10 m L/kg,qd,i.p.）连续处理4天,第4天给予RTV（50 mg/kg,bid,i.p.）;PCN+RTV组以PCN（100 mg/kg,qd,i.p.）连续处理4天,第4天给予RTV（50 mg/kg,bid,i.p.）。将Pxr-/-小鼠随机分为NC组、PCN组和PCN+RTV组（n=6/组）,给药方案同上。检测小鼠血清谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平,肝脏H＆E染色鉴定肝损伤程度。采用实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）和Western Blot检测小鼠肝脏Pxr、Cyp3a11、内质网（ER）应激相关标志物和凋亡相关蛋白的表达水平。提取小鼠肝脏微粒体,体外孵育RTV,用超高效液相色谱-质谱联用技术分析RTV主要活性代谢产物。2.HNF4A-AS1调控HNF4A/PXR/CYP3A4参与RTV致肝毒性机制本部分实验以Huh7和Hep G2细胞系为模型。采用核质分离实验检测HNF4A-AS1和HNF4A在细胞内的定位。q RT-PCR和Western Blot分别检测敲低或过表达HNF4A-AS1、HNF4A或PXR对HNF4A-AS1、HNF4A、PXR和CYP3A4表达的影响。通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）-q PCR技术检测CYP3A4启动子区PXR的富集水平及组蛋白修饰状态。采用乳酸脱氢酶（LDH）含量测定和活性氧（ROS）水平检测,观察HNF4A-AS1和HNF4A对RTV致肝细胞毒性的影响。利用RNA pull-down联合蛋白质谱鉴定HNF4A-AS1的结合蛋白。通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）和免疫共沉淀（Co-IP）技术检测HNF4A-AS1与蛋白及蛋白-蛋白的相互作用。通过放线菌酮（CHX）和MG132实验观察HNRNPC对HNF4A蛋白稳定性的影响。3.验证Hnf4aos在RTV致小鼠肝损伤中的作用本部分实验以WT和Pxr-/-C57BL/6小鼠为模型动物,通过尾静脉注射腺相关病毒特异性敲低小鼠肝脏同源lnc RNA Hnf4aos,采用q RT-PCR和Western Blot检测Hnf4aos敲低后相关基因的表达水平。将WT-AAV-Hnf4aos和WT-AAV-Control小鼠分别分为两组:RTV组和PCN+RTV组;将Pxr-/--AAV-Hnf4aos和Pxr-/--AAV-Control小鼠均设为PCN+RTV组（n=4～5/组）。给药方案、检测指标及方法同上。实验结果1.Pxr激活参与RTV致小鼠肝损伤在WT小鼠中,PCN+RTV组与NC组、PCN组或RTV组相比,血清AST和ALT水平均显著升高,肝细胞肿大变性;肝脏ER应激相关标志物CHOP、GRP78、PDI和XBP-1s表达增加,Bax/Bcl-2比值升高。与NC组相比,PCN组肝脏Pxr和Cyp3a11表达显著增加;提取NC组和PCN组肝脏微粒体,体外孵育RTV,PCN组RTV主要活性代谢产物M1、M12和M17显著增多;PCN+RTV组小鼠与NC组相比肝重系数增大。在Pxr-/-小鼠中,PCN不能诱导肝脏Pxr和Cyp3a11表达,RTV活性代谢产物显著低于WT-PCN组,PCN+RTV组血清AST和ALT水平、肝细胞形态、肝重系数、ER应激相关标志物及Bax/Bcl-2比值与NC组相比无明显变化。2.HNF4A-AS1调控HNF4A/PXR/CYP3A4参与RTV致肝毒性机制2.1 HNF4A-AS1负调控HNF4A/PXR/CYP3A4的表达核质分离实验结果显示,在Huh7和Hep G2细胞中,HNF4A-AS1和HNF4A主要定位于细胞核。敲低HNF4A-AS1后,HNF4A蛋白表达上调,PXR和CYP3A4m RNA和蛋白表达也明显增加。敲低或过表达HNF4A分别降低或增加HNF4A-AS1、PXR和CYP3A4的表达。敲低或过表达PXR分别降低或增加CYP3A4的表达,而对HNF4A和HNF4A-AS1的表达无影响。Ch IP-q PCR结果显示,敲低HNF4A-AS1后,PXR和与基因激活相关的组蛋白修饰H3K4me3在CYP3A4启动子区富集增多;与基因抑制相关的组蛋白修饰H3K27me3富集减少。2.2 HNF4A-AS1参与RTV致肝细胞毒性敲低HNF4A-AS1或过表达HNF4A均明显加重RTV的肝细胞毒性,且敲低PXR可减轻该作用。而过表达HNF4A-AS1可降低RIF合用RTV所致肝细胞毒性。2.3 HNF4A-AS1介导HNF4A与HNRNPC相互作用调控PXR/CYP3A4的表达RNA pull-down联合蛋白质谱鉴定HNRNPC为HNF4A-AS1的结合蛋白。敲低HNRNPC后,HNF4A、PXR和CYP3A4蛋白表达增加。RIP和Co-IP实验结果显示,HNRNPC、HNF4A-AS1和HNF4A三者之间存在相互作用;将RNA降解或敲低HNF4A-AS1后,HNRNPC与HNF4A的相互作用减弱。敲低HNRNPC后,HNF4A蛋白降解减慢,半衰期延长。此外,敲低HNRNPC或过表达HNF4A可逆转HNF4A-AS1过表达引起的PXR和CYP3A4表达下调。3.Hnf4aos在RTV致小鼠肝损伤中起重要作用WT小鼠敲低Hnf4aos后,Hnf4a m RNA表达不受影响,蛋白表达显著上调;Pxr和Cyp3a11 m RNA和蛋白表达均显著增加。将WT小鼠敲低Hnf4aos后给予RTV处理,与AAV-Control-RTV组相比,血清AST和ALT水平升高,肝细胞肿大变性,GRP78、PDI和XBP-1s m RNA表达水平升高,Bax/Bcl-2比值升高;敲低Hnf4aos后,PCN合用RTV与单用RTV相比,血清AST水平显著升高,肝细胞肿大更为明显,Bax/Bcl-2比值升高,且与AAV-Control-PCN+RTV组相比,血清AST水平也显著升高;而在Pxr-/-小鼠中,敲低Hnf4aos未加重PCN合用RTV所致肝损伤。结论1.PXR激活促进利托那韦的生物活化,引起肝脏内质网应激而致肝损伤。2.HNF4A-AS1负调控HNF4A/PXR/CYP3A4通路参与利托那韦致肝细胞毒性。3.HNF4A-AS1介导HNRNPC和HNF4A相互作用,通过影响HNF4A蛋白稳定而调控PXR/CYP3A4表达。4.Hnf4aos在利托那韦所致小鼠肝损伤中起重要作用。