【摘 要】
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背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）在世界范围内的所有的癌症致死病因之中,目前排名第三。缺乏早期诊断方法及新药研发滞后是5年生存率较低的主要原因,因此进一步研究及探索HCC发生、发展的分子机制,寻找新的治疗靶点和研究早期诊断的标志物,这都是肝癌研究领域的核心目标。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,Lnc RNAs）没有翻译成为蛋白质的功能
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背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）在世界范围内的所有的癌症致死病因之中,目前排名第三。缺乏早期诊断方法及新药研发滞后是5年生存率较低的主要原因,因此进一步研究及探索HCC发生、发展的分子机制,寻找新的治疗靶点和研究早期诊断的标志物,这都是肝癌研究领域的核心目标。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,Lnc RNAs）没有翻译成为蛋白质的功能,与此同时,Lnc RNAs含有的核苷酸的数目多于200nt。Lnc RNAs通过调控基因表达,如:转录启动、转录、转录后等多个层面,从而影响肿瘤的发生发展。在已有的结肠癌和前列腺癌的研究中,Lnc RNA VPS9D1反义RNA 1（Lnc RNA VPS9D1 antisense RNA 1,Lnc RNA VPS9D1-AS1）发挥着显著的促进作用,其在HCC中是否发挥着类似的调控作用,仍有待研究。方法:利用NCBI GEO（Gene Expression Omnibus）数据库（GSE65485）和TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库的微阵列数据,比较VPS9D1-AS1在HCC和正常肝组织样本中的表达情况。收集临床样本,通过q PCR检测VPS9D1-AS1在80对HCC肿瘤和癌旁组织中的相对表达量,分析VPS9D1-AS1的表达与HCC的发病及发展之间的关联性。体外合成特异性小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）,用于敲减VPS9D1-AS1。利用pc DNA3.0载体构建pc DNA-VPS9D1-AS1过表达融合质粒,建立VPS9D1-AS1过表达细胞系。通过CCK8和集落形成检测敲减、过表达细胞系的增殖能力。构建VPS9D1-AS1稳定敲减细胞系,皮下植入BALB/c裸鼠,以评估lnc RNA VPS9D1-AS1作为HCC发生调节因子的作用。通过细胞组分q PCR分析VPS9D1-AS1的亚细胞定位。RIP实验筛选VPS9D1-AS1的相互作用蛋白及底物靶向分子,并进一步通过分子生物学及表型实验验证VPS9D1-AS1调控细胞增殖的分子机制。结果:数据库分析显示,VPS9D1-AS1在肝癌中高表达;在本院收集的独立的80对肝癌组织样本中,VPS9D1-AS1在HCC组织中的表达显著增加。VPS9D1-AS1的表达水平升高与肿瘤体积较大、TNM分期较晚有关,其在HCC病人中表达水平越高,生存预后越差。通过小干扰RNA和过表达质粒的转染,成功构建了VPS9D1-AS1敲减和过表达的Hep G2和SMMC-7721细胞系。在细胞中敲减VPS9D1-AS1可降低细胞系的增殖速率和集落形成的活性;相反,过表达细胞系则表现出了增强的增殖能力和集落形成率。在裸鼠成瘤实验中,VPS9D1-AS1稳定敲减细胞系的成瘤能力减弱,15天内的肿瘤体积增长及肿瘤重量显著降低,肿瘤细胞增殖蛋白KI67的表达量显著下降。分子机制的研究发现,VPS9D1-AS1表达定位于HCC的细胞质中。且VPS9D1-AS1在HCC细胞中与Hu R形成复合物,而CDK4的m RNA是Hu R的结合底物。通过敲减Hu R发现HCC中CDK4的m RNA稳定性降低、表达量减少,而VPS9D1-AS1的敲减可以进一步加强Hu R的敲减作用。此外,VPS9D1-AS1的敲减,可抑制Hu R与CDK4的m RNA的结合作用。提示VPS9D1-AS1在细胞内和Hu R协同维持CDK4的m RNA的稳定及表达的功能。进一步的功能实验发现,VPS9D1-AS1的过表达可以增强CDK4的表达,促进细胞的增殖,而抑制Hu R的表达可以抑制VPS9D1-AS1过表达导致的CDK4表达升高和细胞增殖增强的表型。结论:本研究发现HCC组织高表达lnc RNA VPS9D1-AS1。VPS9D1-AS1在HCC细胞中和Hu R结合,协同调控细胞周期调控蛋白CDK4的表达,影响细胞增殖能力,是潜在的诊断及治疗靶点。
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