生猪在屠宰过程中会产生大量的猪血副产物,目前猪血的开发利用主要是以全血为原料应用于食品及饲料工业中,产品附加值较低,尤其对于血液中具有功能活性的蛋白利用率更加不足,这取决于血液中蛋白的常规提取方法如:冷乙醇沉淀法、盐析法、色谱法等存在成本高昂、回收率低、对生产设备和环境要求高、分离操作方法过于繁琐等问题,造成蛋白制备工艺复杂。针对这些问题,本文以猪血为原料,采用双水相萃取分离技术,提取猪血中的功能性质白蛋白,考察不同因素对白蛋白在双水相体系中分配系数和回收率的影响。通过对双水相法提取的猪血浆白蛋白进行结构及性质鉴定,并用柱层析法进行了进一步的纯化。本文主要的结论如下:1、通过双水相体系相图的绘制,确定选用乙醇/磷酸氢二钾体系来提取猪血浆白蛋白,并考察乙醇浓度、磷酸氢二钾浓度、蛋白处理量等因素对双水相体系分离白蛋白的影响。通过响应面实验,得到双水相体系中白蛋白的分配系数与回收率的二元多次回归方程。当乙醇浓度为15%(W/W)、磷酸氢二钾浓度为23%(W/W)、蛋白初始浓度为24 mg/mL时,白蛋白的分配系数和回收率分别为15.71和96.75%。2、采用上述双水相体系制备的样品中蛋白含量为97.35%,与标准白蛋白相比,样品蛋白在紫外光谱290.8 nm下具有最大吸收峰。SDS-PAGE结果表明:该蛋白样品中存在亚基组分为66 kDa的白蛋白以及50 kDa与27 kDa的免疫球蛋白的重链与轻链。红外光谱扫描图显示:样品蛋白保留了标准白蛋白在1649.45 cm-1与1532.65 cm-1处的酰胺I带与酰胺II带特征峰,但是在1075.55 cm-1波数下出现了C=O基团的特征峰,可能是形成了白蛋白聚集体。圆二色谱结果表明:样品蛋白在208 nm和222 nm出现了同样的特征峰,但222 nm色谱峰强度减弱,说明α-螺旋结构有轻微的破坏,样品蛋白的变性温度为61.1 ℃。在不同pH下对样品的溶解性、起泡性和乳化性的测定表明其在pH=4和pH=8处均出现两个极低值,说明所得白蛋白样品中可能混有部分免疫球蛋白。3、为了进一步提纯双水相萃取的白蛋白,采用苯基-琼脂糖凝胶对其进行进一步纯化,考察平衡液pH、所含盐种类及盐含量对洗脱效果的影响。在pH为7的磷酸盐缓冲液中添加0.8 mol/L的磷酸氢二钾,洗脱体积为18～24 mL时,洗脱效果最佳。与双水相法提取的白蛋白相比,纯化后的白蛋白SDS-PAGE图谱表明样品蛋白中含有亚基为66 kDa的白蛋白,50 kDa与27 kDa的免疫球蛋白重链与轻链特征条带得到有效去除,紫外光谱扫描表明样品蛋白在291 nm有特征吸收,红外光谱扫描图显示样品蛋白在1649.45 cm-1与1532.65 cm-1处的酰胺I带与酰胺II带特征峰保留完整,在1084.55 cm-1处的三股螺旋结构有所减少,圆二色谱表明样品蛋白208 nm及222 nm处出现特征吸收峰(α-螺旋结构),说明纯化能完好的保留蛋白的结构,不会使其遭到破坏。