研究背景和目的动脉粥样硬化是以动脉血管壁脂质沉积、内膜增生、炎性浸润和粥样斑块形成为主要病理特征的病变,其引起的心脑血管疾病严重危害人类生命健康。在发达国家及多数发展中国家,动脉粥样硬化发病率逐年升高,已成为人口死亡的主要原因之一,其发病机制非常复杂,受多种因素共同作用,国际学术界提出了多种动脉粥样硬化发病机制学说,如炎症学说、脂质浸润学说、血栓形成学说、氧化学说、损伤反应学说、单克隆学说和免疫学说等。这些学说从不同角度对动脉粥样硬化的发生发展进行了阐述,但都未能完全阐明动脉粥样硬化的发病机制。尽管动脉粥样硬化发病机制非常复杂,受多种因素共同作用,但慢性炎症反应始终是影响动脉粥样硬化发生发展的一个重要原因。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是动脉粥样硬化的重要危险因子,研究发现其具有促进动脉粥样硬化泡沫细胞形成、损伤血管内皮细胞、促进血管平滑肌细胞增殖迁移以及炎性细胞因子释放等作用,参与并促进了动脉粥样硬化的发生和发展。既往的研究证明,胰岛素样生长因子家族(IGFs)与炎症有关,对动脉粥样硬化的发生发展起到了重要作用。IGF家族成员包括IGF配体IGF1和IGF2,细胞表面受体IGF-1R和IGF-2R,以及六种不同类型的结合蛋白IGFBPs。IGF1和IGF2与IGF-1R相互作用,都能作为在结构与功能上与跨膜酪氨酸激酶相互作用的胰岛素受体。IGF2还能与IGF-2R结合,其功能是通过细胞的内吞作用和细胞内降解配体来清除受体。IGF1是通过脑垂体分泌生长激素来控制,而IGF2似乎是由独立的生长激素来控制。据证实,IGF1促进动脉粥样硬化通过血管内皮的部分调节功能。而IGF2与细胞的增殖、生长、迁移和分化有关。C反应蛋白(CRP)是由炎症或组织损伤产生的非特异性的急性时相反应蛋白中最具有代表性的标志物。CRP作为炎性反应的敏感因子,已被证实是反映动脉粥样硬化的敏感指标,CRP浓度的增加伴随着心脑血管事件风险的增加,是一个极有价值的预报因子。巨噬细胞大量摄取低密度脂蛋白(LDL),并将其氧化修饰成Ox-LDL是动脉粥样硬化斑块进展中的一个重要过程。CRP可以直接促进巨噬细胞摄取LDL并被氧化修饰成Ox-LDL,还可刺激巨噬细胞表达细胞因子及组织因子,同时对其他炎症介质的致粥样硬化作用有放大作用。然而在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL、CRP和IGF2三者之间相互作用的关系尚不确定,Ox-LDL是否能影响CRP和IGF2的表达也不确定。本研究中,我们证明了Ox-LDL通过IGF2途径上调THP-1巨噬细胞中CRP的表达。材料与方法1、细胞培养人单核THP-1细胞培养：10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,37℃、5%C02细胞培养箱。取对数生长期细胞进行实验。在每次实验前用100nM佛波酯孵育THP-1细胞72h,诱导分化形成巨噬细胞,更换培养基后加50μg/mlOx-LDL孵育48h使其转化成泡沫细胞。细胞接种在6孔板或12孔板中。2、Ox-LDL的准备将LDL (200 mg protein/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶液加入含硫酸铜(5 mM free Cu2+)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行氧化,37℃孵育24小时。加入含200mM的书二胺四乙酸(EDTA)的PBS溶液终止其氧化反应。然后在37℃下透析48小时以去除Cu2+,最后通过0.45毫米的过滤器进行过滤灭菌。LDL的氧化性是通过硫代巴比妥反应物(TBARS)与丙二醛双(二甲基醇缩醛)(MDA)作为标准。该Ox-LDL中TBARS的含量与LDL中TBARS的含量比是6.0560.16:0.3260.15 nmol/100mg (p<0.01)。新制备的Ox-LDL保存在50 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl and 2.0 mM EDTA中,其保存的pH为7.4,并在使用前十天之内准备。3、实时荧光定量PCR按照TRIzol试剂盒(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)的说明书提取THP-1巨噬细胞的总RNA,将1μg总RNA用反转录成20μl cDNA。以7500系统的实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)检测细胞中mRNA含量,以GAPDH的表达量为内参并以△△Ct方法定量mRNA表达量。本实验采用以下的引物序列IGF2正向,5’-GGAACCCACATTGG CCTGA-3’; IGF2反向,5’-CCGGCGAGGCAGAATATAACAC-3’; CRP正向,5’-AATGTGAACATGTGGGACTTTGTG-3’; CRP反向,5’-CGCCAGTTCAGGA CAT TAGG AC-3’.4、免疫印迹分析用放射免疫沉淀测定缓冲液(Biocolor Ltd., Belfast, Northern Ireland, UK)提取THP-1巨噬细胞中的蛋白,采用BCA量化蛋白测定试剂盒(凯基生物,南京,中国)对蛋白的浓度进行测定。接着向蛋白提取物中加入1/4体积的5(X) SDS,混匀并煮沸10min,冷却置冰箱待用。然后进行Western blotting分析,10%琼脂糖凝胶电泳分离目的蛋白,按流程依次电泳、转膜、封闭后以兔多克隆抗CRP (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)和兔多克隆抗IGF2 (Abcam, Cambridge, MA, USA)一抗孵育过夜,以兔多克隆抗β-actin (Abcam)抗体为内参,洗涤孵育二抗再洗涤后,以化学发光法显示条带,检测目的蛋白的表达。5、siRNAs转染人类IGF2特异性siRNA(IGF2-siRNA)和对照siRNA合成来自锐博生物科技公司(Cambridgeshire, UK)。采用脂质体2000转染细胞(2×106/well)。转染后48小时采用Western blotting分析检测干扰效果。6重组质粒的构建重组质粒从Invitrogen Corporation购买,并通过测序验证,命名为pcDNA3.1-IGF2。采用脂质体2000转染细胞(2×106/well)。转染后48小时采用Western blotting分析检测干扰效果。7、统计处理每组实验重复3次,采用SPSS 13.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行数据分析,计量数据以x±s表示(SDs)。各基因mRNA的相对表达量、各蛋白Western blotting分析条带的相对灰度值比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05认为差异有统计学意义。结果1、Ox-LDL上调THP-1巨噬细胞中IGF2的表达为了研究在巨噬细胞形成泡沫细胞过程中,mRNA表达量可能发生的变化,我们以THP-1巨噬细胞为对照组,以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为处理组进行了基因芯片分析。芯片结果表明,IGF1,IGF2,和CRP基因表达水平分别增加了219,620,和326%。但没有显著的改变IGF-1R,IGF-2R和六种不同类型结合蛋白IGFBPs的基因表达水平。已有研究证明IGF1能促进炎症细胞因子的表达,而CRP被证明是由炎症或组织损伤产生的非特异的急性时相反应中最具有代表性的标志物。因此,我们的目的是探讨在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL能否通过IGF2途径上调CRP的表达。为了达到这个目的,我们通过实时定量PCR和Western blotting来验证THP-1巨噬细胞中Ox-LDL对IGF2表达的影响。结果发现在THP-1巨噬细胞中,不管是实时定量PCR,还是Western blotting分析,Ox-LDL都能在时间和浓度梯度上明显上调IGF2的mRNA和蛋白水平。2、Ox-LDL上调THP-1巨噬细胞中CRP的表达众所周知,炎症反应与血管损伤之间有着密切的联系,并且血管修复在动脉粥样硬化发病过程中起着至关重要的作用。CRP不仅是动脉粥样硬化的重要标志物,而且也能作为一种调节器,参与动脉粥样硬化斑块的形成。而现有的研究证明Ox-LDL在动脉粥样硬化的发生发展中起到了重要的作用。芯片结果显示,在THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中,CRP的表达水平明显高于在THP-1巨噬细胞。因此,我们探讨在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL对CRP表达的影响。结果发现在THP-1巨噬细胞中,不管是实时定量PCR,还是Western blotting分析,Ox-LDL都能在时间和浓度梯度上明显上调CRP的mRNA和蛋白水平。3、IGF2介导了Ox-LDL上调THP-1巨噬细胞中CRP的表达以往的研究表明,IGF家族在炎症反应中起到了重要的调节作用。因此,我们推测在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL通过IGF2途径上调CRP的表达。在THP-1巨噬细胞中用重组质粒过表达IGF2 (pcDNA3.1-IGF2), IGF2蛋白质的表达水平增加到896%,此外,CRP蛋白的表达量也显著增加。并且重组质粒过表达IGF2可加深Ox-LDL上调CRP蛋白的表达水平。接下来,我们研究了IGF2特异性siRNA处理THP-1巨噬细胞对Ox-LDL诱导CRP蛋白表达上调的影响。我们发现在THP-1巨噬细胞中siRNA处理IGF2, IGF2蛋白的表达量下调了90%,此外,CRP蛋白的表达量也明显下调。而siRNA-IGF2减弱了Ox-LDL上调CRP蛋白表达的能力。结论1、发现在THP-1巨噬细胞中,Ox-LDL在时间和浓度梯度上明显上调IGF2和CRP的mRNA和蛋白水平。2、发现在THP-1巨噬细胞中,用重组质粒过表达IGF2可加深Ox-LDL上调CRP蛋白的表达,而用siRNA干扰IGF2的表达会减弱Ox-LDL上调CRP蛋白的表达。说明Ox-LDL通过IGF2途径上调THP-1巨噬细胞中CRP的表达。为动脉粥样硬化的发生机制进行了进一步的阐述。