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间质细胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor-1)是一种趋化因子,它和主要受体CXCR4相互作用,介导干细胞归巢、抑制细胞凋亡等。心肌梗死后,内源性SDF-1分泌在表达量和持续时间上无法满足心肌梗死后机体修复的需求。本研究构建了单质粒心肌特异性缺氧调节SDF-1警戒载体,体内体外实验论证这个单质粒警戒载体的优越性。同时,探讨SDF-1抑制缺氧引起心肌细胞凋亡的机制。[目的]掌握分离间充质干细胞、心脏干细胞的方法；使用H9C2细胞模拟心肌细胞,研究SDF-1基因治疗后SDF-1在缺氧心肌内的表达时间曲线；研究SDF-1能否抑制缺氧应激引起的H9C2、间充质干细胞、心脏干细胞凋亡；探讨这种抑制作用与p-Bad蛋白去磷酸化为Bad的关系。[方法]分离、培养MSCs、CSCs。构建pCMV-hSDF-1-GFP质粒,转染到缺氧的H9C2细胞,Real-time PCR、细胞染色验证转染。Western-blot法检测SDF-1的表达时间曲线。在SDF-1表达高峰时间点(转染后3天)收集条件培养基,以缺氧后内源性SDF-1表达高峰培养基为对照培养基。对比两种培养基对MSCs、CSCs迁移的影响。分析两种培养基对H2O2模拟的缺氧应激引起的H9C2、MSCs、CSCs凋亡的影响(细胞活力试验、台盼蓝拒染法实验、细胞形态),并进一步观察SDF-1条件培养基对在这个过程中p-Bad蛋白去磷酸化为Bad蛋白的影响。[结果]pCMV-hSDF-1-GFP转染缺氧的H9C2细胞后,hSDF-1基因表达是对照组的31倍(p<0.01),转染效率在27.83%±2.61%。SDF-1蛋白在转染后3-7天达到表达高峰,即使14天后SDF-1的表达还较缺氧后内源性SDF-1表达高峰明显。条件培养基较对照培养基促进了MSCs、CSCs的迁移：CSCs34±11 vs.11±3,p < 0.001; MSCs 56±4 vs.10±1,p< 0.001。细胞活力试验：条件培养基组共聚焦显微镜下H9C2、MSCs、CSCs中绿色细胞比例较对照培养基组绿色细胞比例高。台盼蓝拒染法实验：MSCs(条件培养基组84%±7%vs.对照培养基组60%±2%,P<0.01);CSCs(条件培养基组82%±3%vs.对照培养基组62%±3%,P<0.001)；H9C2(条件培养基组89%±3%vs.对照培养基组65%±2%,P<0.001)。形态学上观察H9C2、MSCs、CSCs细胞的区别：对照培养基组可以观察到更多的圆形、光亮的细胞。不同的培养基培养后,Western-blot结果：条件培养基组培养的H9C2、MSCs、CSCs细胞p-Bad的表达较对照组明显,Bad蛋白则相反。细胞染色：在共聚焦显微镜下,条件培养基组培养的H9C2、MSCs、CSCs细胞可以观察到p-Bad的表达。[结论]pCMV-hSDF-1-GFP质粒转染缺氧H9C2细胞后,SDF-1高表达持续超过14天,高峰在3-7天。基因治疗的SDF-1条件培养基可以通过减少p-Bad去磷酸为Bad抑制缺氧引起的H9C2、MSCs、CSCs凋亡。基因治疗的SDF-1条件培养基明显促进了MSCs、CSCs的迁移。[目的]构建单质粒心肌特异性缺氧调节SDF-1警戒载体,体外、体内试验验证这个载体系统的有效性。探讨SDF-1抑制心肌细胞凋亡的机制。[方法]构建单、双质粒心肌特异性缺氧调节SDF-1警戒载体,Real-time PCR对比单双质粒载体hSDF-1的表达。分离原代心肌细胞,转染单质粒载体,对比正常氧、低氧下hSDF-1的表达。探寻单质粒载体启动的时间。叠氮钠模拟缺氧应激,单质粒心肌特异性缺氧调节SDF-1警戒载体转染心肌细胞后,观察心肌细胞的生存,提取条件培养基,用AMD3100阻断SDF-1和CXCR4的相互作用,分为Control、AMD3100、AMD3100+条件培养基、条件培养基组,分析SDF-1抑制心肌细胞时是否磷酸化Akt、p-38MAPK、ERK1/2。体内实验验证单质粒警戒载体能否实现：高效、心肌特异性、缺氧警戒,分为Control组、MI组、假手术+V(警戒载体)组、MI+V组,在心肌梗死后1天分析SDF-1在肝脏、假手术+V组心肌、MI+V组心肌的表达,同时Western-blot和免疫组化法分析心肌组织p-Akt、p-ERK1/2/ p-38MAPK、p-Bad的表达,TUNEL实验评价体内心肌细胞的凋亡。7天后小动物心超分析各组心功能各项参数：EF%(左室射血分数)、LV mass(左室壁心肌重量)、FS%(短轴缩短率)等,通过Masson染色评价心肌纤维化。[结果]成功构建单质粒心肌特异性缺氧调节SDF-1警戒载体,该载体在缺氧条件下hSDF-1基因表达是双质粒载体的2.5倍(p<0.01)。单质粒SDF-1载体在低氧后30分钟,hSDF-1基因开始表达上调(是正常氧浓度下hSDF-1基因的1.5倍),缺氧24小时后对比非缺氧条件上升8.6倍(p<0.01)。单质粒载体转染原代心肌细胞效率在55%±7%；原代心肌细胞分为Normal组,Model组(叠氮钠),SDF组,SDF+叠氮钠组：Normal、Model、SDF组原代心肌细胞在第3天开始出现部分心肌细胞死亡,第5天心肌细胞完全死亡；在SDF+叠氮钠组观察到原代心肌细胞在第9天才开始出现部分心肌细胞死亡,第11天培养的原代心肌细胞完全死亡。对比Control、AMD3100、AMD3100+条件培养基组,SDF-1条件培养基组明显增加了p-Akt、p-ERK1/2、p-38MAPK的表达。体内试验：单质粒载体治疗组心肌组织的SDF-1较非治疗组表达明显,也较治疗组肝脏组织的SDF-1表达明显；Western-blot、免疫组化染色的实验结果表明治疗组p-Akt、p-ERK1/2、p-38MAPK、p-Bad都较未治疗组高表达；单质粒载体治疗组心肌组织中TUNEL阳性细胞数25±2较非治疗组43±8明显少,P<0.01。7天后,心超测定心功能：MI+V组心功能较MI组明显改善,MI+V组和MI组：EF%,36.68±5.21 VS 21.1±2.12,p<0.01;LV Mass,102.85±9.90VS 151.90±9.08,p<0.01；FS%,17.42±2.22 VS 10.05±0.50,p<0.01。Masson染色结果表明：单质粒载体治疗组纤维化面积较未治疗组缩小。[结论]本课题构建的单质粒心肌特异性缺氧调节SDF-1警戒载体具备高效、缺氧警戒、心肌特异性的特点,体外体内实验都证明这个单质粒警戒载体的有效性,是一种良好的基因工具。SDF-1通过促进Akt、ERK1/2、p38MAPK的磷酸化、减少p-Bad蛋白的去磷酸化抑制缺氧刺激引起的心肌细胞凋亡。