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目前，肺脏疾病仍然是世界上高发病率和高死亡率的疾病之一。慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化都已成为高死亡率的肺脏疾病。伴随着气候和环境的改变，人类现在面临的肺脏疾病呈明显增长的趋势。成纤维细胞广泛分布于结缔组织，成纤维细胞的增殖和胶原合成是低氧性肺血管构型重建（pulmonary vascular structural remodeling,PVSR）、肺纤维化和肺组织损伤修复的重要病理特征之一。转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）是一类具有激素样活性的多肽，在调节细胞的生长、分化和功能方面作用广泛。TGF-β1是一种重要的胶原调节因子，可以刺激成纤维细胞的增殖和胶原合成，诱导肺纤维化，是纤维化中最重要、最关键的致纤维化细胞因子。SMAD蛋白是TGF-β1受体下游基因的主要信号转导分子，TGF-β1/SMAD信号在组织纤维化调控中发挥着重要作用。C-myc是高等真核生物最强大的细胞周期进展调控子。研究发现，TGF-β1与c-myc之间存在关联。C-myc下调是TGF-β诱导的癌细胞生长抑制的关键因素，TGF-β1通过抑制c-myc阻断肺纤维化大鼠肺成纤维细胞增殖。TGF-β1增强眼翼状胬肉细胞c-myc表达，c-myc mRNA的升高与TGF-β1呈时间和剂量依赖关系。Smad3与TGF-β1抑制元素结合，导致TGF-β1诱导的c-my启动子活性的抑制，提示c-myc是Smad途径的下游基因。肾上腺髓质素（Adrenomedullin，AM）是一种含52个氨基酸的环状结构肽，最初是从人肾上腺嗜铬细胞瘤中发现的，具有舒张血管、调节细胞生长和凋亡等广泛的生物学功能。AM作为配体通过激活细胞表面的受体发挥作用。AM及AM受体在肺、肾、心脏等多种组织中表达，体内包括成纤维细胞在内的多种细胞可以产生和分泌AM、表达AM受体。AM受体表型不仅取决于受体本身的结构，还取决于受体调控中两个重要的蛋白质——降钙素受体样受体（calcitonin receptor–like receptor, CRLR）和受体活化修饰蛋白（receptor-activity modifying protein, RAMP）。RAMP包括RAMP1、RAMP2和RAMP3异构形式，RAMP包含一个跨膜区域，转送CRLR到细胞表面，RAMP1转送CRLR为CGRP受体，RAMP2或RAMP3转送CRLR为AM受体。AM有两类潜在的受体，肾上腺髓质素受体（adrenomedullin receptor, ADMR）和CRLR-RAMP2或CRLR-RAM3复合物。许多感染因子、生长和分化因子以及激素调控成纤维细胞合成和分泌AM。肺是体内AM合成和分泌的主要场所之一，原位杂交结果显示，在正常肺组织内可见AM mRNA的高表达。AM在肺内的广泛分布提示其可能作为自分泌/旁分泌因子或循环激素在呼吸系统的生理调节中发挥重要作用。AM可以阻止去甲肾上腺素（phenylephrine）诱导的新生鼠心肌肥大。体外培养的新生期心脏成纤维细胞产生和分泌AM，分泌的AM可抑制由血管紧张素（angiotensin，Ang）和内皮素-1（ET-1）诱导的心脏成纤维细胞增殖和蛋白合成，表明AM以自分泌和旁分泌的形式在调节心脏成纤维细胞生长方面发挥重要作用。研究表明，AM和TGF-β1在鼠胚胎发育过程中出现的时间及表达的部位相似，Swiss3T3成纤维细胞合成和分泌AM，肿瘤坏死因子α、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、地塞米松可以促进AM分泌，而TGF-β1和干扰素γ则抑制AM分泌，提示AM和TGF-β1之间可能存在着联系。关于AM与c-myc基因和SMAD蛋白的关系，文献报道较少。研究发现，过度表达c-myc基因的鼠成纤维细胞AM转录水平明显升高，而在包含一个c-myc同型缺失基因的细胞中，AM转录水平降低。AM对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞系（HK-2）Smad2磷酸化无影响，但是阻止了TGF-β1引起的抑制性SMAD6蛋白的降低，提示AM可以缓解TGF-β1介导的肾小管间质ECM重组，其对抗机制可能是通过TGF-β1信号转导途径中的抑制性SMAD6蛋白发挥作用的。上述研究表明，AM与c-myc基因和SMAD蛋白之间存在联系。本研究小组前期工作发现，低氧可以促进人胚肺成纤维细胞增殖和TGF-β1合成分泌增加，AM抑制TGF-β1促成纤维细胞增殖，应用3H-proline掺入方法证实，TGF-β1可以促进成纤维细胞胶原合成和分泌，AM可以抑制TGF-β1引起的成纤维细胞胶原合成和分泌。但AM抑制TGF-β1促肺成纤维细胞增殖和胶原合成的机制是什么？AM对成纤维细胞增殖基因、胶原基因及胶原基因表达下游调控信号通路有无影响？文献未见报道。目的：本实验是在本研究小组以往工作的基础上，进一步研究AM对TGF-β1促肺成纤维细胞增殖基因、胶原基因表达及信号转导通路的影响，以期探讨AM对TGF-β1促肺成纤维细胞增殖和胶原合成的机制，阐明AM在肺损伤中可能发挥的抗纤维化作用。方法：1、体外原代培养人胚肺成纤维细胞（HFLF）、HUVEC和肺癌H1299细胞系，免疫组化观察HFLF中AM的蛋白表达；RT-PCR方法检测HFLF、HUVEC和H1299细胞中AM及AM受体相关蛋白ADMR、CRLR、RAMP1、RAMP2和RAMP3的基因表达。2、MTT方法观察细胞培养24、48和72小时，AM及TGF-β1对人胚肺成纤维细胞增殖的影响。3、Real-time quantitative PCR方法观察AM及TGF-β1对人胚肺成纤维细胞c-myc、Ι型前胶原基因α1（α1(I) procollagen, COL1α1）、Ⅲ型前胶原基因α1（α1(Ⅲ)procollagen, COL3α1）基因表达的影响。4、Western blot方法观察AM及TGF-β1对人胚肺成纤维细胞p-SMAD2/3蛋白表达的影响。结果：1、在HFLF中，AM及AM受体ADMR、CRLR、RAMP1、RAMP2和RAMP3基因均特异性表达，AM、ADMR、CRLR、RAMP2基因表达较高，而RAMP3基因表达较低；而在HUVEC和H1299细胞中，AM及其受体家族成员仅部分表达：在HUVEC中，可检测到AM、RAMP1、RAMP3mRNA表达；在H1299细胞中，可检测到AM、ADMR、CRLR、RAMP1、RAMP3mRNA表达。提示AM可能通过与成纤维细胞膜上的AM受体结合发挥其调控成纤维细胞功能的作用，ADMR、CRLR-RAMP2是重要的受体途径，与HUVEC相比，AM可能在调节HFLF和H1299细胞功能中发挥更重要的作用。2、细胞培养24、48、72小时，AM200nM抑制HFLF增殖，且AM可以抑制TGF-β15ng/ml的促增殖效应。24、48、72小时，AM的抑制作用呈下降趋势，而TGF-β1的促增殖作用呈上升趋势，推测二者在调节HFLF增殖中发挥作用的时限并不同步。3、TGF-β1可以刺激肺成纤维细c-myc、COL1α1、COL3α1基因和p-SMAD2/3蛋白表达，提示c-myc表达升高可能是TGF-β1促成纤维细胞增殖的机制之一，p-SMAD2/3可能是TGF-β1促肺成纤维细胞胶原基因表达的重要信号转导蛋白。4、AM可以抑制基础条件下和TGF-β1促进的c-myc、COL3α1基因表达的升高，同时AM抑制SMAD2/3的磷酸化，即抑制TGF-β-SMAD信号转导通路的激活，提示这可能是AM拮抗TGF-β1的作用以及抑制成纤维细胞增殖和胶原基因表达的机制之一。结论：本研究结果表明，AM及其受体ADMR、CRLR、RAMP1、RAMP2和RAMP3基因在人胚肺成纤维细胞中均特异性表达，ADMR和CRLR-RAMP2是AM重要的受体途径。TGF-β1具有促进成纤维细胞增殖和胶原合成的作用，而AM具有抗肺成纤维细胞增殖和胶原合成的作用，提示AM在PVSR、肺纤维化及肺损伤修复中可能发挥抗纤维化作用，AM通过与其受体结合，进而通过下游SMAD2/3蛋白和c-myc信号转导途径发挥抗纤维化作用。