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目的: 1. 建立一种柱前衍生反相高效液相色谱-荧光检测法同时测定血浆总同型半胱氨酸(total homocysteine,tHcy)、总半胱氨酸(totalcysteine,tCys)、总半胱氨酰甘氨酸(total cysteinylglycine,tCysGly)、总谷胱甘肽(total glutathione,tGSH)的方法。 2. 考察不同抗凝剂、稳定剂以及全血样本离心前放置时间和温度对血浆 tHcy、tCys、tCysGly、tGSH 浓度的影响。 3. 研究尿毒症患者透析前后血浆 tHcy、tCys、tCysGly、tGSH 浓度的变化特点及其与血浆肌酐和血脂的关系并探讨其临床意义。 方法: 1.以 tris-(2-carboxylethyl)-phosphine (TCEP) 为还原剂,7-fluorbenzo-2-oxa-1, 3-diazole-4-sulfonate (SBD-F) 为衍生剂,N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystine,NAC)为内标,C8色谱柱分离,流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液(25 mmol/L,pH 3.0),梯度洗脱,激发波长(λex)380 nm,发射波长(λem)510 nm,内标标准曲线法定量。 2. 用含不同抗凝剂/稳定剂(EDTA、EDTA/氟化钠、EDTA/3DA、柠檬酸钠/氟化钠、草酸钾/氟化钠、肝素/氟化钠)的试管收集全血样重庆医科大学硕士学位论文 3本,置于碎冰或室温中保存,放置 0、3、6、24、48 h 后离心分离血浆,用柱前衍生反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆 Hcy 及其相关硫醇物浓度。3. 用含EDTA的试管收集54例健康人和26例尿毒症患者透析前后静脉血,立即置于碎冰上,1 h 内分离血浆。用反相高效液相色谱-荧光检测法测定血浆 tHcy、tCys、tCysGly、tGSH 浓度。用全自动生化分析仪测定肾功、血脂等生化指标。结果:1. tHcyt、Cyst、CysGlyt、GSH 的线性范围分别 1.0～160.0 μmol/L,30.0～1040.0 μmol/L,2.0～300.0 μmol/L,1.0～130.0 μmol/L,r 为0.9994～0.9999,具有良好的相关性。最低检测限为 0.1～2.0 μmol/L。所测硫醇物(thiol)浓度,日内精密度不超过 3.0%,日间精密度除 tGSH为 13.21%外均小于 6.0%。平均回收率为 87.24%～106.97%。2. ① EDTA抗凝全血样本置于室温中保存,血浆tHcy、tCys、tCysGly、tGSH浓度迅速增加;② EDTA抗凝全血样本置于碎冰上保存,所测血浆硫醇物浓度可稳定48 h;③ EDTA/3DA和EDTA/NaF抗凝全血样本置于室温保存,血浆tHcy、tCys、tCysGly浓度可稳定6 h,tGSH在0～3 h时浓度明显升高;④ 肝素/氟化钠、草酸钾/氟化钠、柠檬酸钠/氟化钠管收集全血,样本置于室温保存,放置6 h后分离血浆,所测得血浆硫醇物浓度无显著变化。重庆医科大学硕士学位论文 43.① 健康成人男性血浆tHcy浓度显著高于女性(p<0.0001),tCys、tCysGly、tGSH浓度男女间无显著差异;② 尿毒症患者透析前血浆tHcy、tCys、tCysGly浓度与正常人相比显著升高(p<0.0001),tGSH显著降低(p<0.0001);③ 尿毒症患者透析后血浆tHcy、tCys浓度较透析前显著降低(p<0.01),tCysGly和tGSH无明显变化;④ 尿毒症患者血浆tHcy浓度分别与tCys(r=0.4582,p<0.01)和Cr(r=0.7536,p<0.01)存在明显正相关;⑤ 尿毒症患者血浆总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)与正常人相比显著降低,甘油三脂(TG)较正常人显著升高。结论:1. 本研究建立的柱前衍生反相高效液相色谱-荧光检测法在国内首次实现了血浆tHcy、tCys、tCysGly、tGSH的同时检测。本方法准确、灵敏、快速、特异,适合于实验室研究和临床常规检测。2. 本研究首次全面考察了全血样本中Hcy、Cys、CysGly、GSH的稳定性,建立了一套科学合理的标本采集、分离与保存的方法,可有效减少人为因素的影响。无论选用何种抗凝剂/稳定剂(EDTA,0℃或柠檬酸钠/氟化钠、肝素钠/氟化钠、草酸钾/氟化钠,室温),均可使血浆tHcy、tCys、tCysGly、tGSH浓度在全血中稳定6 h。但是,柠檬酸钠/氟化钠、肝素钠/氟化钠、草酸钾/氟化钠管收集全血,样本在室温中放置0 h,血浆tHcy浓度比基础值显著低,需要重新定义参考范围。