研究背景:2017年世界卫生组织（WHO）发布了《全球抗生素耐药细菌优先性列表》,并强调:将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）列为第1级（最危急级别）,PA感染的防控和耐药播散已成为亟待解决的重大难题。在开发新型抗生素的同时,研制疫苗和抗体等免疫调控策略,是预防和治疗铜绿假单胞菌感染的重要手段。目前已有4个PA疫苗进入临床试验阶段,其中3个已宣布失败,迄今还未见上市的PA疫苗。抗原是疫苗的核心成分,筛选并制备高质量的保护性抗原是成功研发疫苗的关键。III型分泌系统（Type III secretion system,T3SS）是PA的关键毒力因子,通过“注射”ExoU等致死毒素引起细胞死亡,从而导致感染性疾病。铜绿假单胞菌V抗原（PcrV）是III型分泌系统的组件蛋白,在分泌和转运毒素过程中发挥“开关”作用。因此,PcrV成为重要的免疫调控靶点。研究发现抗PcrV的抗体在体内外可阻断T3SS的功能,预防和治疗PA的感染。此外,编码PcrV的DNA疫苗在小鼠模型上具有良好的保护效果。然而,重组的野生型PcrV蛋白极不稳定,易降解和沉淀,大大限制了其作为基因工程疫苗的应用。结构生物学的进展为疫苗抗原的优化提供了新的策略和手段。本研究从PcrV的结构出发,鉴定其免疫优势结构域,并在此基础上设计和构建新型疫苗分子,评价其免疫原性和保护效果,为下一步研发PA疫苗打下基础。研究目的:解决重组野生型PcrV易降解和沉淀的难题,鉴定其免疫优势结构域,在此基础上设计和构建新型疫苗分子,评价其免疫原性和保护效果。研究方法:1.免疫优势结构域的鉴定。使用I-TASSER Suite,预测PcrV的结构,其由N-terminal(N_ter)、Helix-12(H₁₂)、Helix-7（H₇）、C-terminal(C_ter)四个结构域构成。分别制备重组的四个结构域蛋白,通过ELISA检测其与PA感染恢复期病人血清的反应强度;分别制备抗该四个结构域的抗体,评价其对细菌毒素分泌和活性的影响;综合分析并筛选出PcrV的免疫优势结构域。2.新型疫苗分子PcrV_NH的设计、制备和生化学特性分析。筛选得到PcrV两个免疫优势结构域(N_ter和H₁₂),分析其电荷、空间结构、能量动力学参数等,设计新型融合抗原PcrV_NH;利用pGEX-6P-1表达系统在大肠杆菌中表达PcrV_NH,通过GST Bestarose 4B亲和层析和Hi^TMTrap Q HP离子交换层析纯化制备PcrV_NH蛋白;通过分子筛层析和动态光散射测定PcrV_NH在水溶液中的寡聚状态。3.PcrV_NH免疫保护效果和机制研究。将纯化的PcrV_NH与铝佐剂混合,肌肉注射免疫小鼠三次后:第一,致死剂量PA XN-1气管攻毒,观察小鼠生存率,评价保护效果;第二,亚致死剂量PA XN-1气管攻毒,观察小鼠感染状态、体重、肺脾细菌定植量、肺泡灌洗液中炎性因子水平、肺组织病理改变,明确疫苗保护机制;第三,通过ELISA检测抗PcrV_NH抗体应答的水平和类型,评价PcrV_NH的免疫原性。制备兔抗PcrV_NH的抗体,通过小鼠急性PA肺炎模型,调理吞噬实验,毒素分泌阻断实验,在体内外评价抗PcrV_NH抗体的保护效果和机制。研究结果:1.免疫优势结构域的鉴定结果:生物信息学分析结果表明,PcrV由四个结构域构成,分别为N_ter（Met1-Lys127）、H₇（Arg128-Ala158）、C_ter（Lys159-Pro250）、H₁₂（Leu251-Ile294）。制备重组的MBP-PcrV_full-length、MBP-N_ter、MBP-H₇、MBP-C_ter、MBP-H₁₂,其纯度约分别为90%,95%,90%,93%,94%。将上述蛋白与PA感染恢复期病人血清反应,计算单个结构域相对于MBP-PcrV_full-length的反应强度,发现N_ter和H₁₂相对反应强度均值分别为50%和60%,显著大于H7（25%）和Cter（27%）。成功制备了针对结构域N_ter、H₇、C_ter和H₁₂的抗体,发现抗N_ter和H₁₂抗体可在诱导和非诱导条件下,显著抑制ExoU毒素的分泌,其抑制能力显著强于抗H₇和C_ter抗体。此外,在ExoU介导的细胞毒性抑制实验中发现,抗N_ter和抗H₁₂的抗体可降低T3SS介导的ExoU细胞毒性,而抗H₇和抗C_ter抗体对此过程无明显作用。上述结果表明:N_ter和H₁₂是PcrV的免疫优势结构域。2.新型疫苗分子PcrV_NH的设计、制备和生化学特性分析结果:在对免疫优势结构域N_ter和H₁₂进行生物信息学分析后优化设计并构建新型融合抗原PcrV_NH,其组成方式为N_ter-GSGGSG-H₁₂,并将其在大肠杆菌中表达。使用PP酶处理GST-PcrV_NH,得到可溶的PcrV_NH蛋白。该PcrV_NH蛋白经过HiTrap^TMM Q HP离子交换层析和HiPrep^TM26/10 Desalting层析后,SDS-PAGE检测其纯度约为95%。使用Hiload Superdex 200层析柱测定标准蛋白Blue Dextran 2000、Conalbumin、Ovalbumin、Carbonic Anhydrase、Ribonuclease A、Aprotinin和PcrV_NH的出峰体积分别为40.0 ml、47.3 ml、54.6 ml、62.1ml、73.8 ml、88.2 ml,67.3 ml,以此计算得到PcrV_NH的分子量约为21.2 kDa。动态光散射结果显示PcrV_NH呈单一对称峰,其分子直径大小4.0 nm左右,估算其分子量约为24.9 kDa,表明PcrV_NH在水溶液中是稳定均一的单体。3.免疫攻毒保护实验结果为:0,14,21天肌注免疫各组小鼠,于末次免疫后7天采用PA XN-1菌株攻毒,PBS阴性对照组、MBP阴性对照组、铝佐剂阴性对照组、PcrV_NH实验组、MBP-PcrV_full-length阳性对照组的生存率分别为:0%、0%、0%、50%、50%,PcrV_NH实验组和MBP-PcrV_full-length阳性对照组的生存率与三个阴性对照组相比具有统计学显著差异（P<0.05）,而PcrV_NH实验组和MBP-PcrV_full-length阳性对照组之间并无统计学显著差异（P>0.05）;在仅设置PBS阴性对照组时,分别用致死剂量PA临床菌株ZJ-01（6型）、GZ-18（11型）、BJ-15（10型）、KM-9（2型）攻毒,小鼠的生存率分别为50%,60%,60%,50%,显著高于PBS阴性对照组（P<0.05）;使用亚致死剂量PA XN-1攻毒发现,PcrV_NH免疫组小鼠的精神、食欲、体重、背毛、寒颤等指征评分显著优于阴性对照组（P<0.05）;PcrV_NH免疫组小鼠每毫克组织的细菌定植量显著少于阴性对照组（P<0.05）;肺组织病理观察、炎症病理评分、肺泡灌洗液中中性粒细胞的数量和炎症因子TNF-α和IL-1β的水平显著低于阴性对照组（P<0.05）。4.PcrV_NH免疫原性及抗体应答类型鉴定结果:PcrV_NH抗体可直接与单个结构域N_ter和H₁₂相互作用,表明这两个亚单位在融合蛋白PcrV_NH中形成了正确的构象。此外,脾细胞刺激实验结果显示PcrV_NH免疫可诱导机体产生系统性免疫应答,包括Th1、Th2和Th17。同时,检测抗体亚型结果发现,IgG₁型、IgG_2a型和IgG_2b型的PcrV_NH抗体效价都显著提升,其中IgG₁型抗体水平显著高于IgG_2a型和IgG_2b型（P<0.05）,并且IgG_2a型与IgG_2b型之间并无显著差异（P>0.05）,提示PcrV_NH免疫诱导的免疫反应以Th2型应答为主5.PcrV_NH抗体的保护效果和机制结果:用PA XN-1攻毒时,PBS阴性对照组、非特异性IgG对照组、PcrV_NH抗体实验组小鼠死亡率分别为100%、100%、50%,PcrV_NH抗体实验组小鼠死亡率显著低于对照组（死亡率100%）（P<0.05）,PBS阴性对照组和非特异性IgG对照组小鼠死亡率并无统计学显著差异（P>0.05）。抗体体外调理吞噬实验发现,在不同的浓度下,anti-PcrV_NH抗体对细菌的杀伤作用皆显著强于对照组（P<0.05）,且该效应随着抗体浓度的升高而增强。此外,在诱导型和非诱导型条件下,细菌培养上清中ExoU的含量与加入的anti-PcrV_NH抗体浓度呈显著负相关（P<0.05）。在PA感染细胞模型中,anti-PcrV_NH抗体的加入可显著提高细胞活力（P<0.05）,且该效应随着抗体的减少而降低。综合表明仅anti-PcrV_NH抗体就可通过介导调理吞噬活性、影响T3SS的功能和抑制ExoU的分泌和细胞毒性,从而发挥其保护作用。研究结论:1.PcrV由四个结构域构成,其免疫优势结构域为N_ter（Met1-Lys127）和H₁₂（Leu251-Ile294）,新疫苗分子PcrV_NH的组成为:N_ter-GSGGSG-H₁₂,可通过基因重组在大肠杆菌中实现高效、可溶表达。经离子交换等层析方法,可获得高纯度的PcrV_NH单体（95%）。2.PcrV_NH在PA急性肺炎模型中表现出与全长PcrV同等效力的免疫保护效果,可诱导以Th2为主,Th1和Th17参与的复合免疫应答,表明PcrV_NH是一个良好的PA疫苗候选抗原,为进一步研究PA疫苗奠定了基础。此外,抗PcrV_NH的抗体通过阻断T3SS或介导调理吞噬杀菌作用发挥其保护,为抗体治疗PA感染提供了实验依据。