【摘 要】
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黄曲霉素B1（AFB1）是黄曲霉素亚型中毒性最大的亚型,肝脏是AFB1的靶器官。蒲公英甾醇（Taraxasterol）为蒲公英的主要生物活性成分之一,有抗氧化、抗炎等药理作用。近年来,国内外已有研究证明蒲公英甾醇对胃肠道疾病、肺病、肝损伤、炎症和免疫系统等各种相关病变有潜在的保护作用。为了系统和深刻的认识蒲公英甾醇对AFB1所致肝损伤的干预作用和机理,本试验以蒲公英甾醇为研究对象,通过建立AFB1
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黄曲霉素B1（AFB1）是黄曲霉素亚型中毒性最大的亚型,肝脏是AFB1的靶器官。蒲公英甾醇（Taraxasterol）为蒲公英的主要生物活性成分之一,有抗氧化、抗炎等药理作用。近年来,国内外已有研究证明蒲公英甾醇对胃肠道疾病、肺病、肝损伤、炎症和免疫系统等各种相关病变有潜在的保护作用。为了系统和深刻的认识蒲公英甾醇对AFB1所致肝损伤的干预作用和机理,本试验以蒲公英甾醇为研究对象,通过建立AFB1致鸡原代肝细胞损伤模型,探究蒲公英甾醇经氧化应激及凋亡自噬等途径对AFB1所致的鸡肝细胞损伤的保护作用,为蒲公英甾醇临床上用于防治AFB1性肝损伤奠定理论依据。本试验采用组织块酶消化法提取鸡原代肝细胞,PAS糖原染色鉴定肝实质细胞,采用CCK-8法绘制肝细胞生长曲线,挑选最佳试验时间。MTT法测AFB1的最低染毒剂量,结合细胞上清液中ALT、AST水平,确定AFB1的最低染毒剂量,建立AFB1性鸡原代肝细胞损伤模型,MTT法摸索蒲公英甾醇安全剂量。将细胞进行分组,分为空白组、模型组（AFB1）、蒲公英甾醇给药组（高、中、低剂量组）、阳性对照组（Sil）。测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）活性。q PCR法测定细胞色素酶CYP450 1A5和CYP450 3A37及氧化因子HO-1、NQO1、Keap1、Nrf2m RNA的表达量。Western Blot法测定Nrf2、HO-1、NQO1、Keap1蛋白表达量。q PCR法结合荧光形态学观察探究AFB1致细胞自噬通路中关键因子Beclin-1、LC3-I、LC3-II、ATG-5 m RNA的表达。q PCR法结合流式细胞术探究AFB1致细胞凋亡相关因子Caspase3、Caspase9 m RNA的表达。根据CCK-8结果显示,鸡原代肝细胞在培养2～4 d进行试验最佳。根据MTT结果并结合ALT和AST结果,确定AFB1建模剂量为0.05μg/m L。同时确定蒲公英甾醇在0～25μg/m L区间内无明显毒性作用,因此选择20、10、5μg/m L作为蒲公英甾醇给药高、中、低剂量组。氧化指标结果显示,蒲公英甾醇能提高细胞SOD和GSH的水平,降低MDA和ROS的水平。q PCR结果显示,蒲公英甾醇呈剂量依赖性降低CYP450 1A5、CYP450 3A37、Keap1、Beclin-1、LC3-I、LC3-II、ATG-5、Caspase3、Caspase9 m RNA的过度表达,剂量依赖性升高HO-1、NQO1、Nrf2 m RNA的表达。Western Blot结果显示,蒲公英甾醇能够上调HO-1、NQO1、Nrf2蛋白表达量,下调Keap1蛋白的过度表达。CYTO-ID染色结果显示,蒲公英甾醇能有效降低AFB1所致的细胞自噬。流式细胞术结果显示,蒲公英甾醇能够抑制AFB1所致的细胞凋亡。综上结果表明,蒲公英甾醇主要通过激活Nrf2/Keap1信号通路,提高细胞抗氧化能力,调节凋亡与自噬相关基因的表达,从而对AFB1诱导的肝细胞损伤起到保护作用。
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