核桃多酚作为一种重要的天然活性物质,具有很强的抗氧化作用,在一些与氧化应激相关的疾病中具有极好的修复作用。杀螟硫磷(Fenitrothion,FNT)是一种广泛应用于农业生产的有机磷农药,具有神经毒性、生殖毒性、肝毒性以及免疫毒性。前期研究表明,核桃多酚提取物(Walnut Polyphenol Extract,WPE)有效缓解农药FNT对脾淋巴细胞诱导的细胞毒性,然而其作用机制尚不清楚。本论文以脾淋巴细胞为切入点,在研究WPE对FNT诱导的免疫毒性的缓解作用后,进一步研究其免疫保护作用机制。主要研究结果如下:1.为研究FNT对小鼠脾淋巴细胞的免疫毒性作用,分别用不同浓度的FNT处理脾细胞48h,通过细胞增殖分析实验测定细胞活力。结果显示,在10-7-10-4 M这一浓度范围内,FNT以剂量依赖性的方式抑制脾细胞增殖;在浓度水平为10-4M时,FNT显著抑制脾淋巴细胞生长。同时,为研究FNT暴露时间对其毒性的影响,将脾细胞分别暴露于FNT不同时间后检测其细胞活力,结果显示,FNT以时间依赖性的方式降低细胞生长,当FNT暴露时间为30 min时对脾细胞活力具有显著的抑制作用。以上结果表明,FNT对脾细胞具有细胞毒性作用。2.为研究WPE对FNT毒性的影响,FNT单独或者与不同浓度的WPE(0.5、1.0、5.0和10.0 μg/mL)共同处理脾细胞48h后测定其细胞活力。结果显示,与FNT单独处理组相比,WPE提高了脾细胞活力,且其保护作用具有浓度依赖性,当浓度水平为1.0 μg/mL时,WPE显著提高细胞活力。以上结果表明,WPE对FNT诱导的脾细胞毒性具有保护作用。3.为研究WPE对FNT所致脾淋巴细胞亚群的毒性影响,在有丝分裂原,刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)或脂多糖存在下,FNT单独或者与WPE共同处理脾细胞48 h后测定其细胞活力。同时,FNT单独或者与WPE共同处理脾细胞48 h后,用流式细胞仪进行计数。结果显示,FNT对脾T细胞的细胞活力和增殖具有选择性地抑制作用,WPE能够有效缓解FNT的毒性作用。以上结果表明,WPE具有有效缓解FNT对脾T淋巴细胞诱导的毒性作用。4.为研究WPE对FNT诱导的脾淋巴细胞免疫功能毒性的影响,FNT单独或者与WPE共同处理脾淋巴细胞48 h后,通过酶联免疫吸附试验测定细胞因子的含量。实验结果显示,FNT处理显著抑制T细胞分泌的相关细胞因子的水平,而对B细胞分泌的白细胞介素-6没有明显的影响。当WPE处理后显著增加了 T细胞相关细胞因子的分泌。以上结果表明,WPE能够有效缓解FNT对脾T淋巴细胞免疫功能的抑制作用。5.为研究WPE对FNT诱导的免疫毒性的保护作用的潜在机制,FNT单独或者与WPE共同处理脾淋巴细胞48 h后,测定细胞内活性氧水平和抗氧化物酶活性。结果显示,WPE处理显著减少了 FNT诱导的脾T细胞中羟自由基和丙二醛含量,同时显著提高了细胞中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。以上结果表明,氧化应激与FNT所致免疫毒性具有密切关系,WPE通过其抗氧化作用保护FNT诱导的免疫毒性。6.为研究WPE对FNT所致免疫毒性的保护作用的分子机制,FNT单独或者与WPE共同处理脾淋巴细胞48 h后,通过免疫印迹测定T细胞中NADPH氧化酶-2、双氧化酶-1和Toll样受体-4的蛋白表达。结果显示,WPE(1.0-10.0 μg/mL)以浓度依赖性的方式显著降低了 FNT诱导的脾T细胞中NADPH氧化酶-2、双氧化酶-1和Toll样受体-4蛋白过度表达。以上结果表明,WPE通过调节Toll样受体-4的蛋白表达,降低NADPH氧化酶-2、双氧化酶-1的过度表达,进而降低氧化应激。本项研究结果表明,氧化应激与FNT对脾淋巴细胞诱导的免疫毒性具有密切关系,WPE通过其抗氧化作用有效缓解FNT诱导的免疫毒性作用,其主要机制为:通过调节T细胞表面的Toll样受体-4的蛋白表达,减少FNT所致NADPH氧化酶-2、双氧化酶-1过度表达,降低氧化应激水平,进而减缓FNT的免疫毒性。