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在目前集约化水产养殖模式下,草鱼(Ctenopharyngodon idella)作为我国产量最大的经济鱼类,在实际养殖过程中,特别容易出现肝脏脂肪过度蓄积进而导致脂质代谢紊乱等症状,免疫力也下降,严重者则表现为脂肪肝。因此,如何提高鱼类肝脏对脂肪利用能力及肝脂质蓄积调控的研究已显得非常迫切和必要。近年来,关于microRNA(miRNA)的研究越来越深入。研究显示miRNA参与陆上动物的胆固醇、甘油三酯和脂肪酸代谢等,因而在脂质代谢调控中发挥重要作用。目前,有关miRNA调控鱼类脂质代谢的研究还不深入,相关机理还不明晰。本研究主要以草鱼和草鱼肝细胞系(L8824)为实验材料,采用基因克隆、基因过表达及干扰、qRT-PCR、酶活性测定及腹腔注射等营养学、生物化学、分子生物学和细胞生物学相关技术与方法,在活体与细胞水平上较系统地研究了miR-33/122调控草鱼肝脏脂质代谢的作用及初步机理。研究结果为丰富鱼类脂质代谢调控机理提供了基础资料,为防治鱼类营养性脂肪肝等代谢性疾病及提高机体免疫力提供了思路及理论基础,进而为促进鱼类健康生长提供了科学依据。本文主要的研究结果和结论如下:1.miR-33调控草鱼肝脏脂质代谢研究为探究miR-33调控草鱼肝脏脂质代谢的作用及初步机理,本项研究首先采用RT-PCR技术,克隆了miR-33的前体序列,并进行了同源性比对和组织分布规律分析。结果显示,miR-33的前体长度为65bp,和其它物种的同源性较高;构建系统进化发育树也显示草鱼miR-33和鱼类miR-33的进化关系最近;组织分布规律显示在脑、眼睛、肝脏、肌肉和肠道中表达量较高,而在肾脏、脾脏、心脏和脂肪中的表达量较低。本研究采用miR-33 mimic(miR-33模拟物)转染草鱼肝细胞L8824的方法,开展了miR-33的功能研究。实验设置三个组,空白对照组、阴性对照组和mi R-33 mimic转染组,处理24h后收集细胞。采用油红O染色提取法检测了L8824细胞中甘油三酯(TG)含量,qRT-PCR技术检测了与脂质代谢相关基因的mRNA表达水平。结果显示,相对于空白对照组和阴性对照组,miR-33 mimic转染细胞24h使miR-33超表达后,显著增加了细胞中TG含量(P<0.05),且和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著增加(P<0.05)。为进一步验证miR-33在肝脂质代谢中的功能,本研究亦在活体水平上进行了腹腔注射miR-33 antagomir(miR-33拮抗剂)实验。实验共设置三个组,空白对照组,注射0.65%生理盐水组和注射miR-33 antagomir组(12.5 nmol/尾.次)。实验采用连续注射的方法,即在每天上午9:00注射1次,连续注射3天。在实验进行的第4天上午9:00进行取样。实验采用全自动生化分析仪对草鱼血清相关生化指标进行了分析,qRT-PCR技术对脂质代谢和免疫相关基因转录水平进行了检测。结果显示,注射miR-33 antagomir组比空白对照组和生理盐水组血液中的总胆固醇和甘油三酯含量显著减少(P<0.05);进一步在基因转录水平的研究发现,和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著降低(P<0.05);和免疫有关的促炎因子(TNFα,IL-1β,IL-6和NF-κB)水平降低(P<0.05),而抗炎因子(TGF-β1和IL-10)的表达量升高(P<0.05)。以上结果表明miR-33通过调节脂代谢相关基因和免疫相关因子等的表达在草鱼肝脏脂肪代谢紊乱引起的脂肪肝(炎)过程中发挥重要作用。这一工作也是国际上对鱼类miR-33调节脂质代谢机制的首次阐述。2.miR-122调控草鱼肝脏脂质代谢研究采用和miR-33实验相同的方法,本节实验首先获得了miR-122前体基因序列。结果显示,miR-122前体序列长度为99bp。和其它物种的同源性较高,说明miR-122具有很高的保守性;系统进化关系分析也显示草鱼miR-122和斑马鱼miR-122的进化关系最近;而组织分布规律则说明miR-122仅在草鱼肝脏中特异性的高表达,而在其它组织中尚未检测到其表达。在细胞水平上,本节实验采用在肝细胞L8824中转染miR-122 agomir(miR-122激动剂)方法来研究miR-122的功能。实验分组、实验时间及实验方法等都和miR-33的实验相同。结果显示,和空白对照组及阴性对照组相比,转染miR-122激动剂后,miR-122在L8824细胞中的相对含量明显增加(P<0.05),TG含量显著升高(P<0.05),表明超表达miR-122后促进了脂肪的合成。进一步检测发现,与脂质合成有关mRNA的表达水平也显著增加(FAS,ACC,PPARγ);为进一步研究miR-122的功能,本节研究在活体水平也开展了腹腔注射实验。分组及注射时间和miR-33的实验相同,只是注射剂量变为了5 nmol。结果显示,注射miR-122激动剂后,草鱼肝脏中miR-122的含量明显增加(P<0.05);进一步在基因表达水平的研究显示,注射miR-122 agomirs后,PPARγ,SREBP-1c,ACC,FAS和H-FABP等和脂质合成有关mRNA的表达量显著升高(P<0.05),说明miR-122促进脂肪合成的作用是通过调节脂肪合成基因进行的;检测免疫有关基因的转录水平发现,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的相对表达量出现显著地升高(P<0.05),而抗炎因子IL-10和TGF-β1的相对丰度则明显降低(P<0.05),表明miR-122在促进肝脏脂肪过量增加的基础上可能进一步降低了其免疫力。3.原花青素(GSPE)调节肝脏脂质代谢及miR-33/122的表达为更深入地研究miR-33/122对脂质代谢的调控作用以及开发出能够改善鱼类肝脏脂肪代谢紊乱的绿色饲料添加剂,我们开展了GSPE对肝脏脂质代谢及miR-33/122影响的实验。实验主要分为两部分,(1)在细胞水平研究GSPE对肝脏脂质代谢调控的作用及对相关基因和mi R-33/122表达的影响;(2)在活体水平上进一步验证GSPE的上述作用。在细胞水平上,首先利用不同浓度的油酸构建草鱼脂肪肝细胞模型。然后设置两个实验组,即添加GSPE组和未添加GSPE组。取样的时间设置为0h、1h和3h。实验结束后检测细胞中脂肪含量的变化、miR-33/122的表达水平以及脂质代谢合成相关基因的mRNA水平。在活体水平上,一共分三组,即空白对照组,灌喂生理盐水组和灌喂GSPE组(250mg/Kg),分别在0h、1h和3h取样。检测血清生理生化指标、mi R-33和miR-122的表达变化、脂质代谢和免疫相关基因mRNA表达水平的变化。结果显示,添加GSPE后不论在活体还是细胞水平TG含量都显著降低(P<0.05),miR-33和mi R-122的表达水平也都受到抑制(P<0.05);检测脂代谢相关基因的表达水平发现,灌喂GSPE1h时,脂肪分解相关的基因(CPT-1,ATGL及PPARα)表达量显著升高(P<0.05),而脂合成及转运相关的基因PPARγ及H-FABP表达则显著降低(P<0.05);当灌喂GSPE 3h时,更多脂肪合成基因的表达受到抑制(SREBP-1c,PPARγ,ACC,FAS和H-FABP);对免疫相关基因mRNA表达的检测发现,在脂肪肝细胞中添加GSPE 1h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-?B的表达量都显著下降(P<0.05),而抑炎因子IL-10和TGF-β1的表达显著上升(P<0.05),表明GSPE能够通过调节脂肪肝细胞相关免疫基因的表达而提高机体免疫力的作用,且这种作用是快速和短暂的,因为在添加GSPE 3h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-?B以及抑制炎症因子的表达水平都发生了反转。而在活体水平上,GSPE在灌喂1h时除显著降低促炎因子IL-1β外,对免疫相关的其他基因没有显著性影响;而在灌喂3h时,则显著降低了促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的转录水平(P<0.05),而抑制炎症的因子IL-10显著上升(P<0.05),表明GSPE在活体水平需要较长的时间才能发挥作用,也可能是因为机体内慢性代偿反应的缘故。结果表明,GSPE能改善鱼类的肝脂肪代谢紊乱症状,这可能和GSPE能抑制miR-33和mi R-122的表达进而调节一系列脂代谢和免疫相关基因有关。研究结果为在生产实践中改善饲料配方进而预防脂肪肝(炎)等代谢性疾病提供了理论基础。