论文部分内容阅读
目的:本研究的目的是评估Rg1对T2DM小鼠认知功能障碍的保护作用,并探究其对神经炎症、神经元损伤和钙稳态的影响;其次探讨TRPC6敲除对T2DM小鼠认知功能障碍的影响。方法:1.本实验采用C57 BL/6小鼠,分组为正常对照（Control）组,高脂饲料喂养对照（HFD）组,模型（HFD+STZ）组,人参皂苷Rg1（1 mg/kg,5 mg/kg和10 mg/kg）3组,阳性药对照二甲双胍200mg/kg（Metformin）组。高脂喂养8周后小鼠腹腔注射110mg/kg STZ溶液,造模成功的小鼠给予相应药物治疗8周并连续记录小鼠体重,血糖、摄食量和饮水量的改变。旷场实验观察小鼠的自发活动以及探索行为的变化;Morris水迷宫实验检测小鼠学习能力和空间记忆能力的变化;HE染色,Nissl染色,β-半乳糖苷酶染色等组织学染色检测小鼠大脑皮层和海马区神经元病变以及衰老情况的变化;普鲁士蓝和DHE染色观察T2DM小鼠脑内ROS的积累和血管病变的发生;Aβ1-42免疫荧光染色检测T2DM小鼠脑内Aβ寡聚物的生成情况;Western Blot和RT-PCR检测小鼠脑组织中PSD95,APP,BACE,CTF-β,NCSTN,Aβ1-42,p-Tau,NOX2,p22phox,p47phox,CD36,TRPC6,CN,NFAT1,NLRP1,ASC,Caspase-1,IL-1β等相关蛋白及其m RNA表达的变化。2.采用TRPC6-/-小鼠和同窝出生的WT小鼠,分为WT组,WT+HFD+STZ组,TRPC6-/-组,TRPC6-/-+HFD组以及TRPC6-/-+HFD+STZ组。WT组和TRPC6-/-组实验对象给予其生长维持饲料,其余各组小鼠给予高脂饲料,全部小鼠均可自由获取食物和水。高脂喂养8周后腹腔注射110mg/kg STZ溶液,72 h后测量空腹血糖,空腹血糖≥16.8 mmol/L视为造模成功,同时被筛选入组并继续饲养8周。连续记录小鼠体重,血糖摄食量饮水量的变化,研究TRPC6敲除对T2DM小鼠的影响。旷场实验观察小鼠的自发活动以及探索行为的变化;Morris水迷宫以及条件性恐惧记忆实验被用来检测T2DM小鼠学习和空间记忆能力;取材前通过OGTT实验测定小鼠糖耐量,取材后通过组织学染色如HE染色,Nissl染色,β-半乳糖苷酶染色等研究小鼠大脑皮层和海马区神经元病变以及衰老情况的变化,再通过DHE染色观察T2DM小鼠脑内ROS的积累;Aβ1-42免疫荧光染色探究T2DM小鼠脑内Aβ寡聚物的生成情况;Western Blot和RT-PCR检测小鼠脑组织APP,BACE,NCSTN,NOX2,p22phox,p47phox,CD36,TRPC6,CN,NFAT1,NLRP1,ASC,Caspase-1,IL-1β等相关蛋白及其m RNA表达的变化。结果:1.Rg1具有降低血糖的作用,但效果不如Metformin。随着疾病进展T2DM小鼠在旷场实验中的移动距离,平均移动速度,穿线次数以及探索行为均出现下降,Rg1和二甲双胍治疗能够改善T2DM小鼠的行为表现。水迷宫实验表明Rg1治疗能够改善T2DM小鼠学习记忆能力,且Rg1效果优于二甲双胍。HE和Nissl等组织学染色表明Rg1能够改善T2DM小鼠神经元损伤,衰老以及脑血管病变。PSD95免疫荧光以及WB的结果均表明Rg1和二甲双胍治疗改善T2DM小鼠脑神经元突触损伤。Aβ1-42免疫荧光染色表明Rg1治疗能够改善小鼠脑内淀粉沉积。WB和RT-PCR结果显示Rg1治疗降低了T2DM小鼠脑内NCSTN,Aβ1-42,p-Tau,NOX2,p22phox,p47phox,CD36,TRPC6,CN,NFAT1,NLRP1,ASC,Caspase-1,IL-1β等相关蛋白及其m RNA表达。脑组织匀浆进行Elisa实验表明Rg1能够降低DM小鼠脑内IP3与DAG含量,同时能够降低细胞内Ca2+含量。2.TRPC6敲除对于T2DM小鼠体重减轻和血糖升高具有一定的保护作用。旷场和水迷宫实验表明TRPC6敲除能够改善T2DM小鼠的探索行为和学习记忆能力。HE和Nissl等组织学染色表明TRPC6敲除能够改善T2DM小鼠神经元损伤,衰老。PSD95免疫荧光以及WB的结果均表明TRPC6敲除改善了T2DM小鼠神经元突触损伤。Aβ1-42免疫荧光染色表明TRPC6敲除能够改善小鼠脑内淀粉样蛋白沉积。WB和RT-PCR结果显示TRPC6敲除降低了T2DM小鼠脑内NCSTN,Aβ1-42,p-Tau,TRPC6,CN,NFAT1,NLRP1,ASC,caspase-1,IL-1β等相关蛋白及其m RNA表达,但是对于NOX2,p22phox,p47phox,CD36等蛋白以及m RNA的表达没有影响,同时TRPC6敲除改善了T2DM小鼠神经元钙超载。结论:Rg1能够改善T2DM小鼠的认知功能障碍,敲除TRPC6基因也能够减轻神经炎症、Aβ沉积和钙超载,进而改善T2DM引发的认知功能障碍。Rg1可能是通过抑制NOX2-TRPC6-NLRP1信号通路,发挥认知保护作用,而TRPC6介导的钙稳态可能是T2DM认知功能障碍的潜在治疗靶点。