人巨细胞病毒,属于疱疹病毒亚科,是自然界中普遍存在的病原体,大部分的巨细胞病毒感染是无临床症状的,但是可以在机体中长期潜伏存在,引起免疫缺陷者严重的疾病甚至死亡。近几年来,随着器官移植,免疫抑制治疗,HIV感染者的增加,巨细胞病毒感染的影响越来越受到人们的重视。而且,巨细胞病毒感染也是引起新生儿出生缺陷的主要病原体之一。由于该病毒结构的复杂性,至今对于其确切的致病机理及机体对该病毒感染的保护性免疫反应仍知之甚少,治疗比较困难,有效药物并不多。近年来抗病毒的药物有了很大的发展,抗巨细胞病毒的常用药物的有更昔洛韦,西多福韦,磷甲酸等,但是存在口服药物生物效价低,药效差,一定的毒性以及耐药毒株的问题。随着医药基础理论的不断前进,基因工程的不断发展,通过广大医药工作者的不懈努力,新的抗病毒药不断出现。我校药学院研究开发了一系列的抗巨细胞病毒的药物-噻吩并噻二嗪及其衍生物,与本课题组合作对其进行抗巨细胞病毒药物筛选。目前国内学者常用的抗病毒药物的筛选方法是细胞病变效应法(CPE法),该方法需要的实验周期比较长,比较复杂,但是结果是肯定的。其他国外学者有用DNA杂交技术和流式细胞术检测抗原的方法,但是受到实验室条件和技术的限制。本课题利用分子生物学方法,构建绿色荧光蛋白的巨细胞病毒,建立了一种快速有效的抗巨细胞病毒的药物筛选方法,通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的作用,并拟将该重组病毒进一步用于巨细胞病毒发病机制的研究。 首先,将PHM673质粒转化入大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,扩增纯化后得到大量质粒,酶切鉴定,将质粒直线化,用脂质体转染法转入原代培养的人胚肺成纤维细胞,巨细胞病毒Towne标准株感染转染后细胞,G418筛选,空斑法纯化,PCR鉴定,获得携带绿色荧光蛋白的重组巨细胞病毒。将HCMV-Towne