天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的一道有力屏障。功能正常的天然免疫能使机体长期维持在比较健康的状态,而功能失调的天然免疫,则容易导致各种疾病的发生。免疫调节对维持正常的天然免疫功能至关重要。近年来,关于天然免疫的调节一直都是研究人员感兴趣的研究领域。TLRs是天然免疫细胞上表达的一类主要的模式识别受体,对TLRs信号通路的深入研究将有助于我们对天然免疫调节的全面认识。本课题主要是在巨噬细胞中探讨RasGRP3和Ca2+对TLRs触发的免疫应答强度的调节。第一部分RasGRP3负调巨噬细胞中TLRs触发的IL-6的产生及其分子机制研究天然免疫在宿主抗感染免疫过程中发挥着不可替代的作用。当有病原微生物入侵机体时,天然免疫细胞会第一时间检测到病原微生物入侵并启动抗感染免疫应答。在我们的日常生活中,病原微生物无处不在,我们的皮肤、粘膜等组织时刻都会和病原微生物发生接触,然而在我们体内,天然免疫细胞并不会每时每刻都对它们所监测到的病原微生物启动抗感染免疫应答。在长期进化过程中,天然免疫细胞形成了一套非常完善的启动免疫应答的准入标准：当监测到的病原微生物信号非常微弱时,天然免疫细胞不会产生应答；只有当监测到的病原微生物信号达到一定强度时,天然免疫细胞才会产生应答。这种类似于受阈值控制的免疫应答准入机制,一方面能有效避免机体因过频的免疫应答而导致免疫细胞过度疲劳；另一方面也有利于机体及时清除入侵程度较为严重的病原微生物,从而防止入侵程度过强的病原微生物对机体造成比较严重的危害。目前,对与天然免疫细胞的应答准入机制还不是很清楚。RasGRP家族成员属于鸟核苷酸交换因子,在T/B细胞、血小板以及肥大细胞中发挥着重要功能,而在巨噬细胞中的功能还不是很清楚。我们发现在RasGRP家族成员中,RasGRP3在巨噬细胞中具有较高的表达,并且RasGRP3的表达水平会随着巨噬细胞的活化而发生显著下调；在低剂量的Toll样受体3/4/9(TLR3/4/9)配体作用下,干扰RasGRP3的表达能降低小GTP酶Rap1的活化,促进AKT的去磷酸化,从而增强ERK1/2的活化,并显著增强TLR3/4/9触发的IL-6的表达。此外,体内实验也显示,过表达RasGRP3能抑制IL-6的表达,并能缓解胶原诱导小鼠关节炎的发生。RasGRP3主要能在低剂量刺激物作用下负调IL-6的表达,提示RasGRP3可能为TLRs信号触发的免疫应答设置了一定的阈值,从而使得在极低剂量刺激物作用下,TLRs不会过于频繁地触发免疫应答。因此,我们的研究能为后续探讨天然免疫细胞的应答准入机制提供新的切入点,同时,我们的研究也可能为关节炎的治疗提供新的线索。第二部分Ca2+前馈调节巨噬细胞中TLRs触发的免疫应答及其分子机制研究天然免疫细胞主要通过表达模式识别受体来区分病原微生物上的病原体相关分子,从而监测病原微生物的入侵并启动抗病原微生物的免疫应答。TLRs是在天然免疫细胞上表达的一类非常重要的模式识别受体。关于TLRs的反馈调节,目前已经有了比较深入的研究。然而,关于TLRs的前馈调节,目前却仍不是很清楚。我们观察到巨噬细胞能精细地区分TLRs配体强度,并能根据TLRs配体强度来启动相应强度的免疫应答。巨噬细胞的这种快速而精准的应答需要有多个环节的精细配合才能顺利完成。其中最关键的一个环节应该就是把刺激物的强度信息转变成能被胞内信号通路所感知并被有效传递的信息。胞内的第二信使可能就是这种信号中转的最佳载体。我们发现加入钙离子能以一种剂量依赖的方式增强巨噬细胞的应答强度,用EGTA螯合掉钙离子也能以一种剂量依赖的方式降低巨噬细胞的应答强度。而用siRNA干扰STIMl的表达,阻碍钙离子通过质膜上的钙离子通道进入细胞内,同样也能降低巨噬细胞的应答强度。因此,钙离子可能就是这种特殊的第二信使,它就像一面镜子,能通过改变STIMl介导的钙离子流量来准确地反映刺激物强度的变化,并能将这种变化通过下游信号通路进行传递。我们发现在信号通路环节,作为第二信使的钙离子主要是通过协调小GTP酶Ras和Rapl的功能,来双重调控下游AKT及ERK的活性,从而精确地对巨噬细胞的应答强度进行调节。钙离子介导的这种调节方式类似于一种前馈调节的方式。因此,我们的研究可能为更好地弄清TLRs的前馈调节提供一种新的思路。