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目的：
乳腺癌是发生于女性的常见恶性肿瘤，其发病率随着年龄的增长而增加。根据统计，中国的乳腺癌发病率近年来持续增长，且有逐渐年轻化的趋势。目前主要的乳腺癌治疗手段为外科切除与联合系统化疗以及局部放射治疗。恶性肿瘤的基因治疗是一种特殊治疗手段，由Frederid Moolten在1986年首次提出自杀基因疗法，如今发展为重要的肿瘤新兴治疗方法之一。通过rAAV/TRE/HSV-TK/GCV/DOX阿霉素系统联合化疗药物治疗乳腺癌体内外实验结果显示，这种带有靶向的载体系统联合适当的化疗药物比单用其中任何一种疗法的疗效更好，可见自杀基因是可以对乳腺癌产生很好的杀伤效果的。
果蝇多底物脱氧核苷酸激酶基因(multisubstrate deoxyribonucleoside kinase ofDrosophila melanogaster，Dm-dNK)能够催化自然界中所有嘌呤嘧啶脱氧核苷的磷酸化反应，在其广泛的底物特异性之外，还表现出了高催化率，高出我们所了解的核酸激酶效率的10-100倍。在近年的实验中，研究者尝试使Dm-dNK在癌细胞中表达以起到类似自杀基因的作用，并成功证明了这种酶可以在癌细胞中表达，同时保持酶活性，另外Dm-dNK还可以增加癌细胞对某些化疗药物的敏感性。
选择复制性腺病毒(Conditionally replicating adenoviruses，CRAds)，也称为溶瘤腺病毒，通常情况下只感染肿瘤细胞，对正常细胞没有杀伤效果，其对实体肿瘤效果同样很好。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1（人类免疫缺陷Ⅰ型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
在新的实验中，我们构建了新的病毒载体携带Dm-dNK基因，通过体外、体内试验继续研究其对乳腺癌的杀伤效果。
方法：
一、病毒构建
通过基因操作将目的基因Dm-dNK顺向插入载体pENTR-12的多克隆位点，构建质粒。该质粒与PPE3-ccdB重组后，同SG502共转染至293细胞。9-14天后病毒空斑出现，提取腺病毒DNA，并用PCR验证。
二、酶活性检测
蛋白提取液用放射性[3H]标记作为底物的核苷酸药物，混合液在WhatmanDE-81滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。
三、基因表达的验证
SG500-CMV-DNK病毒感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7以及人胚肺成纤维上皮细胞株MRC-5、WI38后，以TRIZOL方法提取纯化RNA，使用反转录PCR试剂盒对目的基因的表达进行检测。
四、细胞杀伤实验
将人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和正常细胞WI-38、MRC-5铺96孔板，在第二天换为病毒溶液，感染72h后加前药，浓度梯度为0.1μM至100μM，加药4天后结束实验，采用MTT法检测细胞增殖情况。每个实验三次重复。
采用Annexin(V)-FITC双染凋亡检测试剂盒观察治疗后细胞凋亡情况及凋亡比例。乳腺癌细胞和正常细胞在6孔板铺板后感染病毒，并加入核苷酸药物处理，经Annexin(V)-FITC和碘化丙锭双重染色后用流式细胞仪分析凋亡比例。
五、裸鼠移植瘤实验
若干只Balb/c裸小鼠，右侧腋下接种生长良好的肿瘤细胞悬液。待长出150-200mm3的肿瘤后，随机分为治疗组及对照组，隔天注射1次，注射10天后，腹腔注射前药;对照组，腹腔注射PBS共注射10次。观察裸鼠生存及肿瘤大小，用游标卡尺测量肿瘤短径(a)、长径(b)，按公式V=ab2/2计算肿瘤体积，按下式计算抑瘤率:抑瘤率=[（对照组肿瘤的平均体积-实验组肿瘤的平均体积）/对照组肿瘤的平均体积]×100％
结果：
1、选择复制型腺病毒可以在体外感染乳腺癌细胞，且在感染后仍保持其酶活性。
2、该病毒在正常细胞中的感染率及酶活性均远低于其在肿瘤细胞的水平，对肿瘤细胞的杀伤效果也好于对正常细胞，显示出良好的靶向性。
3、在肿瘤细胞中自杀基因与核苷酸类似物联合效应杀伤肿瘤细胞的效果较单自杀基因杀伤肿瘤细胞效果明显。
4、在动物实验中，腺病毒联合化疗药物对肿瘤的杀伤效果同样明显，且对肿瘤体积产生显著的抑制作用。
结论：
自杀基因Dm-dNK可以在乳腺癌细胞系中高水平表达，并保持酶活性。其持续磷酸化多种核苷酸类似物显示出广泛底物特异性及高催化率。
我们构建的病毒能够使Dm-dNK特异性的在乳腺癌细胞系中高水平表达，并保持蛋白激酶活性。同时，病毒的瘤裂解作用，配合作为底物的核苷酸类似物，可通过凋亡方式导致肿瘤细胞死亡远大于对正常细胞的作用。
同样，该病毒介导的自杀基因对小鼠移植瘤的体积也有明显的抑制作用，并可延长小鼠的生存期。
所以，Dm-dNK/核苷类似物这一治疗体系作为新的自杀基因治疗方式，用于治疗肿瘤是有希望并且安全的。