论文部分内容阅读
背景及目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,R.A)是一种慢性的炎症性疾病,以滑膜异常增殖、关节破坏及滑膜免疫细胞浸润为主要特征,包括淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞等。该病主要表现在关节受累上,最终可造成关节破坏、畸形,肢体活动障碍,为家庭及社会增加了沉重的经济负担和心理负担。故早期的发现并及时的治疗、控制疾病的进展,成为重中之重。人类经过多年对RA临床表现的了解,及对其发病机制的探索,明白了RA具有类似于“局部恶性肿瘤”的增生性和破坏性的特点,T淋巴细胞、滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like Synoviocytes,FLS)异常的增殖这一特点是这一病变根本。尽管对该病的发病机理有了一定的了解,仍不能满足目前的医疗需求。长期以来,甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)主要作为RA治疗的首选药物,但一部分患者不能耐受MTX,因其具有明显的胃肠道反应(如恶心、呕吐)、肝功能损害、骨髓抑制等,给RA的治疗带来了困难。因此非常有必要寻找一种有效的、经济的、毒副作用小的药物来替代MTX,亦或是与其作用相当。10-羟基喜树碱(10-Hydroxycamptot.hecine,10-HCPT)是一种普遍应用于多种恶性肿瘤的抗肿瘤药物。经临床验证,效果较为明确,毒副作用较少。我们前期从动物实验及体外实验两方面均证实,在RA中,10-HCPT对T淋.巴细胞的功能具有明显的抑制作用。从抑制细胞增殖方面来说,10-HCPT或许可以成为治疗RA的药物。本研究从FLSs方面着手,探讨10-HCPT对体外培养的FLSs增殖及功能的抑制作用,.为10-HCPT成为治疗RA的有效药物提供理论基础。方法1.收集北京大学人民医院行关节置换术或滑膜切除术的RA患者的关节滑膜组织,进行细胞培养。2.分组:分别用不同浓度10-HCPT、MTX处理细胞,采用MTX作为阳性对照组,不加药物组作为空白对照组。3.检测细胞增殖抑制情况采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法。设置不同的时间梯度、不同浓度梯度,对比10-HCPT与MTX抑制FLSs增殖的情况。4.检测细胞凋亡情况采用流式细胞术法。不同的时间梯度、不同浓度梯度,对比10-HCPT与MTX对FLSs诱导凋亡的情况。5.酶联免疫吸附方法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同的作用时间,不同浓度的FLSs分泌血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平。6.逆转录聚合酶链法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测不同的作用时间,不同浓度的FLSs表达基质金属蛋白酶3-m RNA(matrix metalloproteinase,MMP3;Messenger Ribonucleic Acid,m RNA)的水平。7.应用SPSS16.0、Flowjo软件进行统计分析。结果1.10-HCPT可明显抑制RA-FLSs的增殖,其抑制作用与MTX作用相当(剂量0.1μɡ/ml、1.0μɡ/ml,作用时间24h,P>0.05)。与MTX相比,随着剂量的增大(5.0μɡ/ml、10.0μɡ/ml),作用时间的延长(48h、72h),10-HCPT的抑制作用更强(P<0.05)。2.10-HCPT具有较MTX更强的诱导FLSs凋亡的作用,随着剂量增大,诱导凋亡作用随之增强(P<0.05)。3.用不同浓度10-HCPT及MTX处理FLSs后,VEGF表达量高低不同。与空白对照组相比,10-HCPT高、低浓度组VEGF表达量均显著降低(P<0.05),MTX高、低浓度组则无明显差异(P>0.05)。10-HCPT高、低浓度组与MTX低浓度组比较,VEGF表达量显著降低(P<0.05)。10-HCPT高浓度组与MTX高浓度组比较,VEGF表达量显著降低(P<0.05)。4.与空白对照组比较,不同浓度的10-HCPT及MTX组,MMP3 m RNA表达水平均降低。其中两种药物的高浓度组与对照组比较,MMP3 m RNA表达显著降低(P<0.01)。与10-HCPT低浓度组比较,10-HCPT及MTX高浓度组MMP3m RNA表达均降低(P<0.01)。结论1.10-HCPT具有显著的抑制FLSs增殖、诱导其凋亡、抑制细胞分泌VEGF、抑制细胞表达MMP3 m RNA的作用。2.10-HCPT在RA治疗方面具有潜在的应用价值。