[目 的]肺纤维化（Pulmonary fibrosis,PF）是一种以肺泡上皮损伤、成纤维细胞活化、细胞外基质沉积并炎症损伤的一大类肺疾病的终末期改变。在疾病发现初期,炎性细胞浸润产生大量的致纤维化因子,促使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,从而促进肺纤维化的发生发展。目前临床治疗方法包括抗氧化剂、抗纤维化剂、细胞因子抑制剂等,但效果并不理想。因此,开发新的有效治疗方法至关重要。已有报道间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）具有抑制炎症和抗纤维化的作用,且现有研究发现早期MSCs干预PF动物模型具有抑制肺纤维化的作用,有希望作为PF的新型治疗手段,但干预的机制并不清楚。因此,本课题将采用博莱霉素（Bleomycin,BLM）气管内注射诱导小鼠模型,评估脐带间充质干细胞（Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs）对不同时期PF小鼠的干预效果。并在体外对UCMSCs干预M1型、M2型巨噬细胞和成纤维细胞分化调控作用进行验证。为UCMSCs的应用提供一定的理论基础。[方 法]1.构建肺纤维化动物模型:采用BLM（5 mg/kg）对C57BL/6J小鼠进行气管内注射,诱导小鼠肺纤维化。处死小鼠取肺组织进行HE染色和Masson染色,明确模型是否构建成功。2.UCMSCs干预肺纤维化小鼠模型的有效性研究:实验设置5个组:①对照组6只;②模型组（BLM组）18只;③UCMSCs（day 0）组12只:BLM给药后0 天 UCMSCs 干预;④UCMSCs（day 7）组 12 只:BLM 给药后 7 天 UCMSCs干预;⑤UCMSCs（day 14）组12只:BLM给药后14天UCMSCs干预。通过肺组织HE染色、Masson染色、免疫组化病理学检测以及ELISA检测血清中IL-1β1、TGF-βl的水平,明确UCMSCs不同时期的干预效果。3.体外诱导M1型、M2型巨噬细胞:将THP-1细胞（人单核细胞白血病细胞）经PMA（100ng/mL）48 h诱导为Mφ型巨噬细胞。实验分2组:①M1组:Mφ型巨噬细胞经脂多糖LPS（20ng/mL）和IFN-y（10 ng/mL）48 h诱导成M1型巨噬细胞;②M2 组:经 IL-4（20 ng/mL）和 IL-13（20 ng/mL）48 h 诱导为 M2型巨噬细胞。收集细胞分别进行qRT-PCR验证相关转录因子表达水平,确认M1型、M2型巨噬细胞是否诱导成功。4.体外UCMSCs条件培养基（UCMSCs-CM）干预M1型、M2型巨噬细胞的分化研究:实验分6组:①Mφ组（对照组）;②M1组;③M2组;④M1+UCMSCs-CM组;⑤M2+UCMSCs-CM组;⑥UCMSCs-CM组。48h后分别收集Mφ组、M1组、M1+UCMSCs-CM 组的细胞进行 qRT-PCR 检测 IL-6、TNF-α、CXCL10 转录因子表达水平以观察对M1型巨噬细胞分化的干预作用,收集Mφ组、M2组、M2+UCMSCs-CM 组、UCMSCs-CM 组的细胞检测 CD163、fibronectin、CCL18、CCL22、IL-10转录因子表达水平以观察对M2型巨噬细胞分化的干预作用。5.体外TGF-β1诱导walvax-2细胞（人胚肺成纤维细胞）分化为肌成纤维细胞:实验分3组,分别为对照组、10 ng/mLTGF-β1组、20 ng/mLTGF-β1组。分别培养24 h和48 h后收取细胞。Western Blot检测walvax-2细胞的α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白含量。6.体外UCMSCs-CM干预TGF-β1诱导walvax-2细胞分化为肌成纤维细胞的研究:选取10 ng/mLTGF-β1对walvax-2进行诱导。实验分3组,分别为对照组、10 ng/mL TGF-β1 组、10 ng/mL TGF-β1+UCMSCs-CM 组。48 h 后收取细胞进行Western Blot检测,观察干预后α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白含量变化。[结 果]1.成功构建PF小鼠模型:BLM气管注射后,C57BL/6J小鼠肺组织HE和Masson染色结果显示,7 d肺组织开始出现明显炎症细胞浸润,14 d时炎性细胞浸润进一步加重,同时出现水肿、肺泡间隔增粗和细胞外基质沉积等改变,至28 d病变最明显。对照组中,肺组织结构完整,未见明显炎症及细胞外基质沉积。2.UCMSCs抑制PF小鼠炎性细胞浸润和纤维化形成:采用UCMSCs对PF小鼠模型进行干预,UCMSCs（day 0）组和UCMSCs（day 7）组干预后,PF小鼠肺组织HE染色和Masson染色显示炎症和细胞外基质沉积均有明显改善;TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ和F4/80免疫组化染色显示表达均明显减少。UCMSCs（day 14）组肺组织中HE染色显示炎症反应有所改善,但Masson染色显示细胞外基质沉积无明显缓解,α-SMA和Collagen Ⅰ的免疫组化结果显示表达无明显减少,而F4/80和TGF-β1的免疫组化表达减少,血清中TGF-β1和IL-1β1的表达水平同样减少。BLM组前28 d变化与前面相似,从35 d开始,炎症、水肿、肺泡间隔增粗、细胞外基质沉积等病理改变开始恢复,至42 d病变明显减少。3.成功诱导了 M1、M2型巨噬细胞:LPS和IFN-γ诱导M1 型巨噬细胞,qRT-PCR检测M1型巨噬细胞相关转录因子IL-6、TNF-α、CXCL10的表达水平升高有统计学差异（P＜0.05）。IL-4和IL-13诱导M2型巨噬细胞,qRT-PCR检测M1型巨噬细胞相关转录因子CD163、fibronectin、CCL22、IL-10的表达水平升高有统计学差异（P＜0.05）。4.UCMSCs-CM抑制了 M1分化、促进了 M2分化:UCMSCs-CM对M1型和M2型巨噬细胞分化过程进行干预后,M1+UCMSCs-CM组中M1型巨噬细胞相关转录因子TNF-α、CXCL10的表达水平降低有统计学差异（P＜0.05）。而M2+UCMSCs-CM组中M2型巨噬细胞相关的转录因子fibronectin、CCL22、IL-10的表达水平升高有统计学差异（P＜0.05）。单用UCMSCs-CM同样使Mφ巨噬细胞使大部分M2型巨噬细胞相关的转录因子升高有统计学差异（P＜0.05）。5.TGF-β1成功诱导walvax-2分化为肌成纤维细胞:两种不同浓度的TGF-β1诱导walvax-2细胞分化,Western Blot检测结果显示walvax-2中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白高表达。6.UCMSCs-CM抑制TGF-β1诱导walvax-2分化为肌成纤维细胞:UCMSCs-CM干预TGF-β1诱导walvax-2分化过程,干预后的Western Blot结果及其灰度值统计发现,Western Blot检测结果显示UCMSCs-CM的干预能够使TGF-β1诱导的walvax-2细胞中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表达减少有统计学差异（P＜0.05）。[结论]1.成功构建肺纤维化小鼠模型。2.UCMSCs在早期（0天和7天）和晚期（14天）进行干预均能抑制炎症反应。3.UCMSCs早期（0天和7天）进行干预能抑制纤维化的形成,晚期（14天）干预仅能延缓进展。4.UCMSCs-CM可能通过抑制M1型巨噬细胞分化,促进M2型巨噬细胞分化,从而改善肺纤维化。5.UCMSCs-CM可能通过抑制TGF-β1对walvax-2细胞的诱导分化为肌成纤维细胞,从而改善肺纤维化。