【摘 要】
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天女木兰（Magnolia sieboldii K.Koch）是一种集观赏和药用价值于一身的国家三级保护树种,因其种子具有深度生理休眠的特性,解除天女木兰种子休眠成了育苗工作亟待解决的问题。种子的休眠和萌发受到种子内源激素和外界环境的共同调控,光作为主要的环境因子在大多数植物的种子萌发过程当中起到抑制萌发的作用,自然光中主要是蓝光对种子的休眠解除有抑制作用,隐花色素（Cryptochrome,CR
【基金项目】
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国家自然科学基金“天女木兰光敏色素蛋白PHYs对加速种子休眠解除的调控及其作用机制”（项目编号NO.31971647）
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天女木兰（Magnolia sieboldii K.Koch）是一种集观赏和药用价值于一身的国家三级保护树种,因其种子具有深度生理休眠的特性,解除天女木兰种子休眠成了育苗工作亟待解决的问题。种子的休眠和萌发受到种子内源激素和外界环境的共同调控,光作为主要的环境因子在大多数植物的种子萌发过程当中起到抑制萌发的作用,自然光中主要是蓝光对种子的休眠解除有抑制作用,隐花色素（Cryptochrome,CRY）作为蓝光受体使种子感应到蓝光并调控下游信号使种子内脱落酸（ABA）的含量升高从而抑制种子萌发。为探究不同光质对天女木兰种子休眠的影响,本研究从蓝光受体隐花色素蛋白CRYs入手,以通量测序获得的天女木兰种子转录组数据为参考,从天女木兰中克隆得到了两个隐花色素基因Ms Cry1和Ms Cry2,并对它们的结构特征、表达特征、对种子内源激素的调控以及在植物中的功能进行了分析和鉴定。本研究主要结果如下:1.成功分离得到Ms Cry1和Ms Cry2基因序列,全长分别为2103 bp和1953 bp,分别编码700和650个氨基酸。Ms Cry1和Ms Cry2是CRYs基因家族的两个不同基因。Ms Cry1编码蛋白分子式为C3496H5353N985O1050S17,相对分子量是78.527 k D,p I为5.44;Ms Cry2编码蛋白分子式为C3313H5079N909O969S23,相对分子量是73.885 k D,p I为5.69。均为不稳定蛋白。2.Ms Cry1和Ms Cry2都具有Phr B超级家族结构域,PHR结构域是蓝光受体隐花色素基因都具有的N端保守结构域,并且Ms Cry1含有CCE结构域。亚细胞定位预测结果显示,Ms Cry1和Ms Cry2定位于叶绿体内的可能性最大。蛋白的二级结构预测发现,在Ms Cry1蛋白中,α螺旋占40.29%,无规则卷曲占45.14%,延伸链占9.86%,β转角占4.71%;在Ms Cry2蛋白中,α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角的占比分别为36.46%、48.46%、9.69%和5.38%。Ms Cry1和Ms Cry2编码蛋白的三级结构与分别以CRY1蛋白c1u3c A和CRY2蛋白c6k8k A为模体,相似性分别为69%和74%。3.天女木兰种子吸胀处理可激活Ms Cry1和Ms Cry2。在吸胀0-48h内Ms Cry1和Ms Cry2表达量呈波动变化,吸胀24 h时,两个基因表达量均达最高,其中Ms Cry1表达量呈极显著性,Ms Cry2表达量呈显著性。4.不同光照条件下,Ms Cry1和Ms Cry2的相对表达量均呈现出先降低再升高的趋势,且相对表达量依次是蓝光＞白光＞红光。因此,Ms Cry1和Ms Cry2为天女木兰中响应蓝光受体基因,可以感受到环境中的蓝光信号。且天女木兰种子在蓝光层积0-24 d,ABA合成相关基因Ms NCED3的表达量呈上升趋势,ABA代谢基因Ms CYP707A1的表达量呈下降趋势,说明在蓝光条件下种子内的ABA含量升高,由此推测Ms Crys对天女木兰种子萌发的抑制是通过调节种子内ABA合成和代谢基因的表达量,增加种子内ABA含量进而调控种子休眠。5.构建了Ms Crys-p CAMBIA-1302植物表达载体并转化农杆菌,将Ms Crys转入拟南芥中通过抗性筛选和分子鉴定得到了T3代转基因种子,对Ms Crys进行功能验证,测定转基因拟南芥种子在蓝光下的萌发率,cry1缺失突变体拟南芥的萌发率最高,Ms Crys过表达植株的萌发率最低,野生型拟南芥和cry1缺失突变体Ms Cry1恢复植株的萌发率相似,说明天女木兰隐花色素基因Ms Crys能够特异性响应蓝光信号并降低拟南芥种子的萌发率。
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