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目的探讨硫代乙酰胺(TAA)体外诱导BMSCs向破骨样细胞的分化,分析诱导过程中破骨样细胞形态、蛋白表达和骨代谢标志物表达水平的变化,为TAA导致骨质疏松症的毒性研究提供实验依据。方法1.体外无菌分离,培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并对细胞进行表面分子检测。2.CCK-8实验筛选硫代乙酰胺诱导BMSCs细胞分化的最佳作用浓度;CFSE检测硫代乙酰胺对BMSCs细胞分裂的影响。3.流式细胞术检测TAA对细胞凋亡,周期的影响;Western Blot法检测凋亡相关蛋白的表达的变化4.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色对BMSCs分化的破骨细胞进行特异性形态学染色5.Western Blot法检测破骨细胞特异性蛋白表达的变化6.免疫荧光法检测破骨细胞特异性蛋白表达的变化7.Fluo-3 AM荧光检测BMSCs细胞内钙离子的变化8.电化学发光法检测BMSCs骨代谢标志物的变化结果1.在体外无菌分离并培养具有干细胞标志物的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),可以用于本次实验研究。2.CCK-8实验结果显示:TAA能抑制BMSCs细胞增殖,并且呈剂量-时间依赖性;CFSE结果显示TAA能抑制BMSCs细胞分裂。3.流式细胞术结果显示:TAA能够导致BMSCs细胞凋亡,阻滞在S期的细胞显著增加。4.TRAP染色结果显示:分别诱导3天和7天后,与对照组相比,RANKL联合M-CSF组,TAA 0.5mg/mL组和TAA 1mg/mL组中TRAP染色阳性细胞数量均显著增加(P<0.05),且获得阳性细胞数量多于RANKL联合M-CSF诱导组。5.Western Blot实验结果显示:分别诱导3天和7天后,与对照组相比,RANKL联合M-CSF组,TAA 0.5mg/mL组和TAA 1mg/mL组中破骨细胞特异性蛋白TRAP和Cathepsin K蛋白表达上调,6.免疫荧光实验结果显示:分别诱导3天和7天后,与对照组相比,RANKL联合M-CSF组,TAA 0.5mg/mL组和TAA 1mg/mL组中破骨细胞特异性蛋白:TRAP和Cathepsin K蛋白表达上调。7.Fluo-3 AM结果显示:TAA作用于BMSCs后,细胞内钙离子增加。8.骨代谢标志物检测结果显示:分别诱导3天和7天后甲状旁腺激素和N端骨钙素表达水平上调,1-25-羟维生素D表达水平下调。结论1.体外成功无菌分离、培养、鉴定骨髓间充质干细胞。2.TAA能够抑制BMSCs增殖,可以促进BMSCs凋亡及阻滞细胞在S期。3.TAA能够诱导BMSCs分化为破骨细胞形态学特异性染色阳性的破骨样形态细胞。4.TAA能够上调破骨细胞特异性蛋白TRAP和Cathepsin K蛋白的表达。5.TAA能够增强骨再吸收标志物的表达和骨转换率。