镉(Cd)是一种二价重金属元素,过量的Cd积累会危害人类健康、影响植物生长。通过Cd胁迫下转录组测序分析,发现水稻OsLCD3受Cd诱导表达。OsLCD3具有磷酸激酶结构域,没有转运功能,也不属于解毒蛋白,探讨OsLCD3对Cd响应的机理及其功能具有重要理论意义。本研究通过CRISPR/Cas9技术获得突变体lcd3,结合转录组测序、酵母双杂交等技术,对OsLCD3在水稻中生物学功能以及在镉离子运输调节中的作用进行了初步研究。主要结果如下:1.利用OsLCD3的基因组序列设计基因编辑靶位点,构建OsLCD3-Cas9敲除载体,以日本晴为背景,通过遗传转化获得43株基因编辑的敲除水稻,鉴定到23株阳性植株,包括12株纯合体和11株杂合体。克隆出OsLCD3基因的CDS片段,通过同源重组的方法将其连到有2×35S启动子的pHB过表达载体上,转入水稻中,经鉴定得到4株阳性植株,选取纯合突变体lcd3-1(-7bp)、lcd3-19(-5bp)、OE-2、OE-3进行后续实验。2.对lcd3-1,lcd3-19和WT的主要农艺学性状进行观察和统计,发现突变体的千粒重显著高于WT,结实率显著低于WT,lcd3突变体籽粒明显大于WT的籽粒,但种子萌发率显著下降。对过表达株系OE-2、OE-3的籽粒进行观察和分析,发现过表达株系的千粒重明显低于WT,籽粒明显小于WT。3.lcd3突变体籽粒出现垩白,对WT和突变体淀粉相关的理化性质进行了分析。发现lcd3突变体种子的总淀粉含量极显著低于WT,蛋白质含量极显著高于WT。4.对lcd3-1、lcd3-19敲除突变体幼苗期进行Cd处理,发现lcd3-1、lcd3-19突变体的生长状态比WT好。对其Cd含量进行测定,结果显示,与WT相比,突变体的地下部分和地下部分的Cd含量明显降低。5.将lcd3-1、lcd3-19敲除突变体和WT种植于总Cd含量为7.0mg/kg的土壤中,测量植株各器官中的镉含量。发现不论在根、茎、叶、壳、籽粒中,lcd3突变体的Cd含量都显著低于WT。6.对OsLCD3的组织表达进行半定量和定量分析。在幼苗期,OsLCD3在地上部分高表达,开花期,主要表达于茎、叶、叶鞘、节、花,通过GUS活体染色观察,在幼苗期主要在叶上表达,特别是叶枕表达最高,在开花期,主要在节、叶枕、壳、花药、柱头上表达。7.利用酵母双杂交技术筛选水稻cDNA文库共获得26个可能与OsLCD3具有相互作用的蛋白。功能分析初步确定,筛选获得的互作蛋白可能参与脂质运输和代谢;参与细胞内运输和分泌,在植物中参与某些信号转导途径来应对非生物胁迫;可能参与离子运输;其中有7个跨膜蛋白;此外,还有激酶,如酪蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、磷酸-甘油酸-激酶;推测OsLCD3基因可能调控其他金属转运蛋白来调节水稻体内镉的转运,并且还可能在植物的生长发育、抵抗逆境等过程发挥着重要作用。8.RNA-seq测序结果分析表明,在转录水平上,WT与突变体lcd3共有的表达基因数为37421个,lcd3本身特有的表达基因数为2706个。GO富集分析得出,WT与lcd3之间有显著差异的基因有52个,其中27个基因表达量上调,25个基因表达量下调,大多数基因被定位于细胞膜,分子功能与结合作用相关,调控转录活性,参与植物信号转导,对刺激物积极响应,以及细胞生长等多种生物过程。9.对OsLCD3进行了的亚细胞定位分析。将内质网红色荧光标记物Bip-RFP与pCUbi1390-OsLCD3-GFP共转化于水稻原生质体,在激光共聚焦显微镜下RFP荧光与GFP荧光可以较好地重叠,表明OsLCD3定位于细胞的内质网上。综上,OsLCD3不仅可以调节水稻对Cd离子的吸收,OsLCD3基因的缺失可减少水稻体内Cd离子的积累,减少Cd毒害,还可以调控籽粒大小,影响籽粒中淀粉含量和蛋白浓度,参与植物生长发育和代谢过程。