背景:心脏是脊椎动物胚胎发育过程中最早形成和发挥功能的器官,其发育经历着从细胞系决定、线性心管形成和环化到心腔分隔及瓣膜形成等一系列复杂的形态发生事件,最终形成成熟的左右心房心室的四腔结构。与之相应的,心脏发生发展的分子机制涉及众多基因的顺序表达和多种信号通路(如BMP、Notch、Wnt等信号通路)在时间和空间上的精细调控,构成一个错综复杂的调控网络。近年来,心脏发育的分子机制研究已经取得了较大的进展,但对于整个调控网络仍然知之甚少,许多具体机制仍然不很明确。微小RNA(miRNA)调控功能的发现,为进一步开展心脏发育调控机制的研究带来了新的思路。miRNA是一类长度18-22nt的非编码RNA,主要在转录后水平对靶基因进行负向调节,介导靶mRNA的降解或者抑制其转录后翻译,导致靶蛋白表达降低,参与了细胞增殖、凋亡、代谢、免疫、信号转导等诸多生物学过程。越来越多的研究成果证实miRNAs在心脏发育与疾病发生过程中同样起着重要的调控作用,但其影响心脏发育的具体机制尚未阐明,这也使得miRNA调节心脏发育的机制研究成为国际心血管研究的热点。本研究小组前期研究发现怀有先天性心脏病胎儿的孕妇血清miR-29c表达显著上调,提示miR-29c可能与心脏发育畸形密切相关。然而,查阅文献发现miR-29c关于心脏发育调节的研究尚处于空白,其在心脏发育中的调节机制和功能仍然未知。本研究承接前期研究工作,利用P19细胞模型,进一步探索miR-29c在心脏发育中的作用和机制。目的:探索miR-29c表达沉默对P19细胞增殖、凋亡和分化等细胞功能的影响及其发挥调节作用的机制。方法:(1)构建miR-29c沉默海绵体并转染P19细胞,嘌呤霉素筛选miR-29c持续稳定表达沉默的细胞株,荧光观察和qRT-PCR验证miR-29c沉默效率。(2)CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期;(3)饥饿诱导P19细胞凋亡,流式细胞计数结合Hoechst染色检测凋亡情况,qRT-PCR和Westem blot验证凋亡相关基因BCL-2/BAX的表达变化;(4)二甲基亚砜诱导P19细胞分化,qRT-PCR和Westem blot检测心肌特异性标记物GATA4、cTnT、MEF2C表达情况,明确miR-29c沉默对P19细胞分化的影响。(5)生物信息学分析结合荧光素酶报告实验明确miR-29c靶基因,qRT-PCR检测P19细胞分化过程中靶基因及其作用元件的表达变化。结果:miR-29c沉默组细胞与对照组相比,增殖速率更快,细胞周期S期比例高;miR-29c沉默组细胞凋亡率低于对照组,BCL-2表达高于对照组而BAX表达无明显差异;P19细胞分化第6天和第10天miR-29c沉默组GATA4、cTnT、MEF2C的表达水平显著低于对照组;Wnt4证实为miR-29c靶基因,P19细胞分化过程中miR-29c沉默组Wnt4和β-catenin的表达高于对应时间点的对照组,对照组WNT4/β-catenin表达量随分化时间逐渐递增而在miR-29c沉默组持续高表达。结论:miR-29c表达沉默促进P19细胞增殖,抑制P19细胞凋亡和分化,Wnt4是miR-29c靶基因,miR-29c表达沉默可能通过激活WNT4/β-catenin信号通路发挥调节作用。