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[目的]培养扩增出抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞,并观察其免疫抑制功能,为今后临床利用抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞诱导器官移植免疫耐受提供新思路。[方法]本实验分两部分：第一部分,提取小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞：利用免疫磁珠分选系统分选Balb/c小鼠脾脏的CD4+CD25+Treg细胞,包括阴性分选获得CD4+T细胞,阳性分选获得CD4+CD25+Treg细胞。并用流式细胞仪检测分选后细胞的纯度及Foxp3表达率。第二部分,培养扩增抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞：①提取C57小鼠脾细胞,经丝裂霉素C灭活后与提取的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞(10：1)于96孔培养板中混合培养,培养基选用RPMI1640完全培养基,配以10%胎牛血清、rmIL-22000U/mL、雷帕霉素100nmol/mL,37℃,5%CO2、100%湿度培养箱中培养14天,第3、5、7、9、11天换液,第14天收集细胞；②T细胞增殖抑制实验,检测培养后CD4+CD25+Treg的抗原特异性。实验分成四组：第一组(实验组)：C57小鼠CD4+CD25T细胞+培养后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾细胞；第二组(对照组)：C57小鼠CD4+CD25T细胞+未培养的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾细胞；第三组(空白对照组)：C57小鼠CD4+CD25T细胞+C57小鼠脾细胞；第四组(第三方对照组)：昆明小鼠CD4+CD25T细胞+培养后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾细胞。通过观察比较各组CD4+CD25T细胞增殖情况的不同判断扩增出来的CD4+CD25+Treg是否有抗原特异性。③不同浓度CD4+CD25+Treg对T细胞的增殖抑制试验：将培养后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg与C57小鼠CD4+CD25T细胞分别按0.5：1、1：1、2：1、4：1、8：1混合培养,观察各孔中CD4+CD25T细胞的增殖情况。④数据用统计软件SPSS14.0软件进行统计学处理。正态分布的变量,两组之间比较采用独立样本t检验；非正态分布变量比较采用秩和检验。检验水准α=0.05。[结果]第一部分：利用免疫磁珠分选系统,经阴性分选及阳性分选,可分选出纯度达90%的CD4+CD25+Treg细胞,Foxp3表达率达95%以上,其分离方法稳定、高效,可用于进行相关研究。第二部分：1.C57小鼠特异性CD4+CD25+Treg细胞的培养扩增：Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞加入C57小鼠脾细胞(1：10),经过14天培养后,Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞约扩增10倍。2.T细胞增殖抑制试验：各组培养72小时后,流式细胞检测结果显示：①实验组中C57小鼠原代CD4+CD25T细胞比例明显比对照组中的高(86.0%±3.9%VS.40.6%±1.9%,P<0.05),因此利用C57小鼠脾细胞扩增出的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞比新鲜提取的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞对C57小鼠CD4+CD25T细胞抑制作用强。②实验组中C57小鼠原代CD4+CD25T细胞比例明显比空白对照组中的高(86.0%±3.9%VS.6.8%±3.4%,P<0.05),对照组中C57小鼠原代CD4+CD25T细胞比例也比空白对照组中的高(40.6%±1.9%%VS.6.8%±3.4%,P<0.05)。可得出结论,新鲜提取和利用C57小鼠脾细胞培养后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞对C57小鼠CD4+CD25T细胞均有抑制作用。③实验组中C57小鼠原代CD4+CD25T细胞比例明显比第三方对照组中的高(86.0%±3.9%VS.33.5%±3.0%,P<0.05),说明利用C57小鼠脾细胞培养后的Balb/c小鼠CD4+CD25+Treg细胞对昆明小鼠CD4+CD25T细胞的抑制作用不如对C57小鼠CD4+CD25T细胞的抑制作用。因此,培养后CD4+CD25+Treg并非抑制作用加强,其对C57小鼠CD4+CD25T细胞的抑制作用增强是特异性的。由此得出结论：CD4+CD25+Treg细胞对同种异体CD4+CD25T细胞均有一定的抑制作用,利用脾细胞可以培养扩增出抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞。3.不同浓度抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞的T细胞增殖抑制试验：培养48h后,各孔原代CD4+CD25T细胞比例分别为：11.1%、14.1%、23.1%、40.6%、49.6%。因此,随着CD4+CD25+Treg细胞比例的增高,其抑制作用是随之增强的。[结论】1.本实验利用免疫磁珠分选系统,经过阴性分选和阳性分选两步法,得到高纯度的CD4+CD25+Treg细胞,此方法是理想的体外分离CD4+CD25+Treg细胞方法。2.本实验利用脾细胞成功培养扩增了具有抗原特异性的CD4+CD25+Treg细胞,此方法经济、简单、实用。3.本实验验证了CD4+CD25+Treg细胞对效应性T细胞的抑制作用,并证明这种抑制作用存在于同种异体之间,但其对特定抗原的抑制作用不如抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞。4.本实验还证明,抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞对效应性T细胞的免疫抑制作用受二者比例的影响,随着CD4+CD25+Treg比例的增高,其抑制作用也随之增强。