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第一部分人外周血内皮祖细胞及Tip血管内皮细胞的分离培养与鉴定目的：探讨人外周血内皮祖细胞的分离与培养方法,拟证实人外周血是内皮祖细胞除了骨髓以外的另一个理想来源。并在一定的体外培养条件下将外周血内皮祖细胞定向诱导分化为Tip血管内皮细胞,研究其生物学活性,不仅为进一步实验研究提供所需的细胞来源,还为干细胞源性血管新生机制提供可靠的实验室依据。方法：采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,将其重悬于EGM-2-MV培养基中培养,每日于倒置相差显微镜下观察细胞的生长形态及内皮祖细胞集落形成形态,每隔3-4天换一次液,培养7天后收集贴壁细胞,根据内皮祖细胞特性,用流式细胞仪检测内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR等表面标志物以鉴定培养诱导后细胞主要为内皮祖细胞。培养至21天时倒置相差显微镜下观察Tip血管内皮细胞形态,并收集该时期的贴壁细胞进行RT-PCR检测Tip血管内皮细胞中vWF、eNOS等血管内皮细胞系特异性基因的表达情况。结果：分离获得的单个核细胞培养4天后多数呈贴壁生长,7天后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR分别为(66.3±2.14)%、(79.8±1.47)%、(94.6±1.93)%。继续培养21天后的细胞呈鹅卵石样改变,并伸出伪足相互连接形成类似血管腔样结构,形态学表现为Tip血管内皮细胞的形态特点,RT-PCR实验检测该细胞有血管内皮细胞系特异性基因vWF、eNOS的表达。结论：可以成功从人外周血中分离具有增殖分化潜能的内皮祖细胞,并在体外诱导分化可表达各种内皮细胞特异性抗原,如eNOS、vWF等。同时经过特定的体外诱导培养体系可将其扩增并定向诱导为Tip血管内皮细胞。第二部分SDF-1对外周血Tip血管内皮细胞迁移能力的影响及AMD3100对其的干预目的：研究探讨SDF-1/CXCR4生物学轴对Tip血管内皮细胞的生物学影响,本实验旨在通过应用一定浓度的趋化因子SDF-1及CXCR4受体的抑制剂AMD3100,以体外培养的Tip血管内皮细胞为研究对象,观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对外周血Tip内皮细胞迁移能力的影响及AMD3100对其的干预,旨在为临床开展Tip血管内皮细胞移植治疗性血管新生奠定基础。方法：收集第一部分实验中培养21天后的贴壁Tip血管内皮细胞,将细胞悬液分为7个组：阴性对照组,3个不同浓度(20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml)的SDF-1诱导组,2个AMD3100干预组(50ng/ml SDF-1+AMD3100组,100ng/ml SDF-1+AMD3100组),单纯AMD3100组。Transwell实验检测不同浓度的SDF-1对外周血内皮祖细胞来源的Tip血管内皮细胞迁移能力的影响及AMD3100对其的干预。结果：50ng/mk100ng/mlSDF-1均能诱导Tip血管内皮细胞的迁移,迁移能力明显高于对照组(P<0.05),20ng/ml SDF-1诱导的迁移能力与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);单纯AMD3100组使Tip内皮细胞的迁移能力降低,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),10ng/ml AMD3100共同孵育有效阻断100ng/mlSDF-1诱导Tip内皮细胞迁移,迁移能力与阴性对照组相比无统计学意义(P>0.05),10ng/ml AMD3100不仅阻断了50ng/ml SDF-1诱导的迁移,还表现出抑制Tip内皮细胞迁移的效应,迁移能力明显低于阴性对照组(P<0.05),也明显低于10ng/ml AMD3100共同孵育后的100ng/mlSDF-1诱导迁移组(P<0.05)。结论：50ng/ml、100ng/ml SDF-1能促进体外培养外周血Tip血管内皮细胞的迁移能力,其受体拮抗齐AMD3100可阻断这种活性；单纯MD3100可降低Tip内皮细胞迁移能力；SDF-1/CXCR4通路参与Tip血管内皮细胞的体外迁移。