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自从2002年在高温加工食品中发现大量丙烯酰胺以来，由此引发的食品安全问题引起了国内外的广泛关注。目前对于丙烯酰胺的研究逐渐由体外转向体内，对丙烯酰胺体内暴露水平、代谢分析方法、生物标志物监测和解毒防护途径的研究成为相关领域科学家关注的重点。本论文系统地研究在动物水平上丙烯酰胺体内短、中、长期暴露水平及儿茶素化学防护下各类暴露生物标志物的变化趋势，深入解析在儿茶素干预下丙烯酰胺体内代谢暴露谱的变化。
本论文首先建立了基于同位素稀释的超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）的同步检测方法，用于丙烯酰胺和环氧丙酰胺及其巯基尿酸加合物的定量分析。通过化学合成制备和结构鉴定，获得了4种丙烯酰胺巯基尿酸加合物及其同位素内标的标准品。对于大鼠尿液采用沉淀蛋白后直接稀释处理，对于人体尿液采用Oasis?HLB和Isolute ENV+柱相结合的固相萃取净化方法，利用Waters ACQUTITY UPLC?HSS T3色谱柱及其0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相体系，大鼠尿液中丙烯酰胺和环氧丙酰胺及其巯基尿酸加合物检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别达到0.1-0.6ng/mL和0.4-2.7ng/mL；人体尿液中丙烯酰胺和环氧丙酰胺及其巯基尿酸加合物LOD和LOQ分别达到0.2-0.8ng/mL和0.7-5.8ng/mL。同时，采用质谱电喷雾离子源（ESI）正负切换模式，通过多重反应监测模式（MRM）对目标物进行定量分析。
其次，通过对雌雄SD大鼠灌胃的方式给予1mg/kg bw、10mg/kg bw和50mg/kg bw的丙烯酰胺，观察48h内丙烯酰胺毒代动力学及代谢物水平，并采用茶多酚、酯型儿茶素——表没食子酸儿茶素没食子酸酯（EGCG）和非酯型儿茶素——表儿茶素（EC）研究丙烯酰胺体内代谢水平及化学防护效果。研究发现，儿茶素化合物显著促进丙烯酰胺以巯基尿酸加合物的形式排出体外，其对雌性大鼠的防护效果好于雄性大鼠，并且主要通过以GA和GAMA为主的氧化代谢途径对丙烯酰胺的体内代谢发挥防护效果。深入分析表明，儿茶素对丙烯酰胺代谢的防护作用可能与其黄烷醇结构中酚性羟基有关。
丙烯酰胺及其初级代谢产物环氧丙烯酰胺可与血红蛋白结合形成血红蛋白加合物，反映了丙烯酰胺在体内中期的暴露水平。鉴于此，建立了适用于大鼠和人体血液分析的丙烯酰胺血红蛋白加合物的定量检测方法。通过分离红细胞制备血红蛋白，利用五氟苯基异硫氰酸酯（PFPITC）进行Edman降解，将丙烯酰胺和环氧丙烯酰的血红蛋白加合物从血红蛋白肽链N端的缬氨酸残基脱下，衍生为AAVal-PFPTH和GAVal-PFPTH进行定量分析。选择Supelclean LC-18固相萃取柱对血红蛋白衍生液净化富集，应用ESI-模式下MRM定量方式的UHPLC-MS/MS方法对丙烯酰胺血红蛋白加合物进行分析。大鼠中丙烯酰胺血红蛋白加合物的LOD和LOQ分别为2.5-3.6pmol/g Hb和7.5-11.8pmol/g Hb，人体中丙烯酰胺血红蛋白加合物的LOD和LOQ分别为1.4-5.0pmol/g Hb和4.8-16.8pmol/g Hb。该方法灵敏度高、分析时间短、操作简便，为评估丙烯酰胺体内中期暴露水平提供了方法支持。
然后，通过SD大鼠实验评估丙烯酰胺在不同灌胃剂量下的体内暴露水平，同时研究儿茶素干预对大鼠体内丙烯酰胺中期代谢的影响。研究发现，非酯型儿茶素通过抑制雄鼠中GA-Hb的代谢，从而对丙烯酰胺血红蛋白加合物的总代谢量起到了抑制效果，而酯型儿茶素促进了丙烯酰胺通过AA-Hb途径代谢，降低了丙烯酰胺向环氧丙酰胺转化的比率。这可能是由于EC结构中的3-位官能团与EGCG不同，从而导致其对丙烯酰胺体内毒性的防护位点不同。结合毒代动力学和生理学利用药理代谢的房室模型，基于血红蛋白加合物构建丙烯酰胺生物内暴露与膳食外暴露的关联模型，并进行了验证。
为了研究丙烯酰胺DNA加合物的暴露水平及儿茶素的防护效果，本文随后建立了适用于大鼠尿液、人体尿液和大鼠组织样本的丙烯酰胺DNA加合物定量分析方法。对大鼠尿液样本采用直接稀释处理方法，对人体尿液样本采用固相萃取净化处理方法，对大鼠组织样本采用试剂盒提取DNA后生物酶解结合物理热裂解的处理方法，采用不同基质水平的基质加标曲线，采用UHPLC-MS/MS方法进行外标法定量分析。结果表明，SD大鼠在灌胃不同剂量丙烯酰胺后通过尿液代谢的丙烯酰胺DNA加合物约占灌胃剂量的1.4%-2.1%。脏器中肝脏的DNA加合物最低，N7-GA-Gua约为6.8-42.1adducts/108Nucleotides，N3-GA-Ade约为3.7-6.7adducts/108Nucleotides；肾脏和心脏中丙烯酰胺DNA加合物含量相当，N7-GA-Gua约为9.3-832.7adducts/108Nucleotides，N3-GA-Ade约为7.3-25.9adducts/108Nucleotides。茶多酚、EGCG和EC均有效抑制了DNA损伤，并对肾脏具有保护作用。在儿茶素干预下，灌胃不同剂量丙烯酰胺的SD大鼠肝脏中均未检出丙烯酰胺DNA加合物，心脏中丙烯酰胺DNA加合物含量没有显著性变化。
最后，在儿茶素干预条件下，探索大鼠尿液中丙烯酰胺体内代谢暴露标志物水平变化以及干预前后的暴露谱差异性。通过对大鼠灌胃13C3-丙烯酰胺，跟踪其体内代谢进程并描绘其暴露谱，进而通过EGCG和EC干预的方法丙烯酰胺体内差异性代谢物；收集大鼠16h的尿液样本，采用超高效液相色谱串联高分辨四极杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q-Exactive-HRMS）对大鼠尿液进行暴露谱解析。首次发现大鼠尿液中存在N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酰-亚砜（AAMA-sul），但含量极少。大鼠尿液的质谱数据通过代谢软件与统计学软件进行处理，建立了正交偏最小二乘判别分析模型（OPLS-DA），利用模型计算筛查得到了大鼠尿液中27种13C3-丙烯酰胺差异代谢产物，并通过数据库对比与定性分析鉴定出13种差异代谢物的结构式。同样筛查得到了75种13C3-丙烯酰胺在EGCG与EC干预下体内差异代谢物，并鉴定出21种差异代谢物的结构式。
本研究首先从短、中、长期暴露角度构建了丙烯酰胺暴露标志物的定量分析方法，对于进一步开展代谢动力学分析、内外暴露关联和生物标志物暴露水平监测提供方法学支持；其次，通过在动物水平采用儿茶素干预代谢的方式，探索其在体内防护丙烯酰胺的作用位点；最后，本研究基于暴露谱水平和同位素示踪技术寻找丙烯酰胺新型暴露标志物和差异性代谢物，完善了丙烯酰胺体内的暴露谱研究。本研究完整地对丙烯酰胺体内暴露水平进行了阐述，从营养毒理学角度寻找体内防护作用位点，建立了靶向暴露-暴露谱-营养干预三位一体的研究模式，为丙烯酰胺内外暴露关联和生物内暴露与健康效应关联研究提供了方法学依据，对于其他食品加工污染物的研究具有借鉴意义。
本论文首先建立了基于同位素稀释的超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）的同步检测方法，用于丙烯酰胺和环氧丙酰胺及其巯基尿酸加合物的定量分析。通过化学合成制备和结构鉴定，获得了4种丙烯酰胺巯基尿酸加合物及其同位素内标的标准品。对于大鼠尿液采用沉淀蛋白后直接稀释处理，对于人体尿液采用Oasis?HLB和Isolute ENV+柱相结合的固相萃取净化方法，利用Waters ACQUTITY UPLC?HSS T3色谱柱及其0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相体系，大鼠尿液中丙烯酰胺和环氧丙酰胺及其巯基尿酸加合物检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别达到0.1-0.6ng/mL和0.4-2.7ng/mL；人体尿液中丙烯酰胺和环氧丙酰胺及其巯基尿酸加合物LOD和LOQ分别达到0.2-0.8ng/mL和0.7-5.8ng/mL。同时，采用质谱电喷雾离子源（ESI）正负切换模式，通过多重反应监测模式（MRM）对目标物进行定量分析。
其次，通过对雌雄SD大鼠灌胃的方式给予1mg/kg bw、10mg/kg bw和50mg/kg bw的丙烯酰胺，观察48h内丙烯酰胺毒代动力学及代谢物水平，并采用茶多酚、酯型儿茶素——表没食子酸儿茶素没食子酸酯（EGCG）和非酯型儿茶素——表儿茶素（EC）研究丙烯酰胺体内代谢水平及化学防护效果。研究发现，儿茶素化合物显著促进丙烯酰胺以巯基尿酸加合物的形式排出体外，其对雌性大鼠的防护效果好于雄性大鼠，并且主要通过以GA和GAMA为主的氧化代谢途径对丙烯酰胺的体内代谢发挥防护效果。深入分析表明，儿茶素对丙烯酰胺代谢的防护作用可能与其黄烷醇结构中酚性羟基有关。
丙烯酰胺及其初级代谢产物环氧丙烯酰胺可与血红蛋白结合形成血红蛋白加合物，反映了丙烯酰胺在体内中期的暴露水平。鉴于此，建立了适用于大鼠和人体血液分析的丙烯酰胺血红蛋白加合物的定量检测方法。通过分离红细胞制备血红蛋白，利用五氟苯基异硫氰酸酯（PFPITC）进行Edman降解，将丙烯酰胺和环氧丙烯酰的血红蛋白加合物从血红蛋白肽链N端的缬氨酸残基脱下，衍生为AAVal-PFPTH和GAVal-PFPTH进行定量分析。选择Supelclean LC-18固相萃取柱对血红蛋白衍生液净化富集，应用ESI-模式下MRM定量方式的UHPLC-MS/MS方法对丙烯酰胺血红蛋白加合物进行分析。大鼠中丙烯酰胺血红蛋白加合物的LOD和LOQ分别为2.5-3.6pmol/g Hb和7.5-11.8pmol/g Hb，人体中丙烯酰胺血红蛋白加合物的LOD和LOQ分别为1.4-5.0pmol/g Hb和4.8-16.8pmol/g Hb。该方法灵敏度高、分析时间短、操作简便，为评估丙烯酰胺体内中期暴露水平提供了方法支持。
然后，通过SD大鼠实验评估丙烯酰胺在不同灌胃剂量下的体内暴露水平，同时研究儿茶素干预对大鼠体内丙烯酰胺中期代谢的影响。研究发现，非酯型儿茶素通过抑制雄鼠中GA-Hb的代谢，从而对丙烯酰胺血红蛋白加合物的总代谢量起到了抑制效果，而酯型儿茶素促进了丙烯酰胺通过AA-Hb途径代谢，降低了丙烯酰胺向环氧丙酰胺转化的比率。这可能是由于EC结构中的3-位官能团与EGCG不同，从而导致其对丙烯酰胺体内毒性的防护位点不同。结合毒代动力学和生理学利用药理代谢的房室模型，基于血红蛋白加合物构建丙烯酰胺生物内暴露与膳食外暴露的关联模型，并进行了验证。
为了研究丙烯酰胺DNA加合物的暴露水平及儿茶素的防护效果，本文随后建立了适用于大鼠尿液、人体尿液和大鼠组织样本的丙烯酰胺DNA加合物定量分析方法。对大鼠尿液样本采用直接稀释处理方法，对人体尿液样本采用固相萃取净化处理方法，对大鼠组织样本采用试剂盒提取DNA后生物酶解结合物理热裂解的处理方法，采用不同基质水平的基质加标曲线，采用UHPLC-MS/MS方法进行外标法定量分析。结果表明，SD大鼠在灌胃不同剂量丙烯酰胺后通过尿液代谢的丙烯酰胺DNA加合物约占灌胃剂量的1.4%-2.1%。脏器中肝脏的DNA加合物最低，N7-GA-Gua约为6.8-42.1adducts/108Nucleotides，N3-GA-Ade约为3.7-6.7adducts/108Nucleotides；肾脏和心脏中丙烯酰胺DNA加合物含量相当，N7-GA-Gua约为9.3-832.7adducts/108Nucleotides，N3-GA-Ade约为7.3-25.9adducts/108Nucleotides。茶多酚、EGCG和EC均有效抑制了DNA损伤，并对肾脏具有保护作用。在儿茶素干预下，灌胃不同剂量丙烯酰胺的SD大鼠肝脏中均未检出丙烯酰胺DNA加合物，心脏中丙烯酰胺DNA加合物含量没有显著性变化。
最后，在儿茶素干预条件下，探索大鼠尿液中丙烯酰胺体内代谢暴露标志物水平变化以及干预前后的暴露谱差异性。通过对大鼠灌胃13C3-丙烯酰胺，跟踪其体内代谢进程并描绘其暴露谱，进而通过EGCG和EC干预的方法丙烯酰胺体内差异性代谢物；收集大鼠16h的尿液样本，采用超高效液相色谱串联高分辨四极杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q-Exactive-HRMS）对大鼠尿液进行暴露谱解析。首次发现大鼠尿液中存在N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基)-L-半胱氨酰-亚砜（AAMA-sul），但含量极少。大鼠尿液的质谱数据通过代谢软件与统计学软件进行处理，建立了正交偏最小二乘判别分析模型（OPLS-DA），利用模型计算筛查得到了大鼠尿液中27种13C3-丙烯酰胺差异代谢产物，并通过数据库对比与定性分析鉴定出13种差异代谢物的结构式。同样筛查得到了75种13C3-丙烯酰胺在EGCG与EC干预下体内差异代谢物，并鉴定出21种差异代谢物的结构式。
本研究首先从短、中、长期暴露角度构建了丙烯酰胺暴露标志物的定量分析方法，对于进一步开展代谢动力学分析、内外暴露关联和生物标志物暴露水平监测提供方法学支持；其次，通过在动物水平采用儿茶素干预代谢的方式，探索其在体内防护丙烯酰胺的作用位点；最后，本研究基于暴露谱水平和同位素示踪技术寻找丙烯酰胺新型暴露标志物和差异性代谢物，完善了丙烯酰胺体内的暴露谱研究。本研究完整地对丙烯酰胺体内暴露水平进行了阐述，从营养毒理学角度寻找体内防护作用位点，建立了靶向暴露-暴露谱-营养干预三位一体的研究模式，为丙烯酰胺内外暴露关联和生物内暴露与健康效应关联研究提供了方法学依据，对于其他食品加工污染物的研究具有借鉴意义。