研究背景：　　EB病毒(Epstein-Barr,EBV)为双链DNA病毒,是一种嗜人B淋巴细胞病毒,属于疱疹病毒γ亚科家族中的一员。EBV在人群中普遍易感,我国是EBV感染高流行的国家,儿童中以非肿瘤性的EBV相关疾病较多见,包括传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis,IM),慢性活动性EBV感染(chronic active Epstein-Barr virus infection,CAEBV)和EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(EBV-associated hemophagocytic syndrome,EBV-AHS)等。噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)是多种原因造成自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和T细胞功能缺陷,引起大量炎症细胞因子释放,造成机体巨噬细胞活化,机体脏器、组织损伤的一组临床综合征。主要表现为持续发热,全血细胞减少,肝、脾、淋巴结肿大,黄疸,骨髓、淋巴结等组织可见吞噬细胞现象,中枢神经系症状,抽搐或神经瘫痪也常发生。多种原因可引起HLH:遗传因素、感染、肿瘤、自身免疫系统疾病,EBV-AHS是感染所致HLH中的常见类型。无论是原发性还是继发性HLH,EBV感染都是最常见的触发因素。HLH病因及发病机制复杂,临床表现具有特征性但缺乏特异性,易与传染性单核细胞增多症、脓毒症、自身免疫性疾病、病毒感染和造血系统恶性疾病相混淆,并且病情进展迅猛而凶险,如不及时给予诊断及治疗,则预后差,死亡率极高,因此如何提高HLH的早期诊断,实施有效的治疗,是临床工作中亟待解决的问题。　　血清铁蛋白作为一种急性时相蛋白,在感染、炎症性疾病和恶性肿瘤中明显升高。国际组织细胞协会(Histiocyte Society)在2004年制定的HLH-04诊断标准中把血清铁蛋白>500ug/L作为其中一条新增的重要实验室指标。然而有研究报道,330例铁蛋白>500ug/L的患者中仅10例确诊为HLH,而铁蛋白>10000ug/L时对确诊HLH的敏感性达90％,特异性为96%,如伴发热则有98%特异性。铁蛋白的检测方法已经从传统的酶免法、放免法发展到化学发光法。目前大部分临床检验室采用酶联免疫吸附法检测血清铁蛋白水平,其检测上限为2000ug/L,而HLH患儿的血清铁蛋白远高于该水平,故有人指出提高临床血清铁蛋白的检测上限有利于对HLH疾病的早期诊断及病情分析,因此,本研究中应用最大范围可达40000ug/L的化学发光免疫分析法检测血清铁蛋白水平。　　CD163是一种仅仅在单核细胞-巨噬细胞系细胞膜上表达的跨膜糖蛋白分子,具有单核细胞-巨噬细胞特异性,可作为巨噬细胞活化的标记。由CD163分子胞外段释放的sCD163也能产生抗炎,免疫作用。sCD163是巨噬细胞活化的重要标志物。HLH中也存在大量巨噬细胞活化,因此,Jordan等人提出把血清sCD163的升高作为HLH的诊断指标之一。　　可溶性IL-2受体alpha链(sIL-2Ra,sCD25)主要来源于Treg细胞膜表面CD25的脱落,是T淋巴细胞激活的指标之一。sCD25水平升高可见于器官移植、排斥反应、病毒性和细菌性感染、恶性肿瘤、创伤和自身免疫病等,所以,HLH-2004诊治指南中提出的sCD25>2400U/ml,临床实践中这样的指标也可常见于恶性疾病及感染性疾病,但若sCD25水平极高(>10000pg/ml)常可提示HLH,当HLH患者血清sCD25>20000pg/ml,常提示预后不佳。　　调节性T细胞(Treg cell)是一类以表达IL-2受体alpha链(CD25)为特征具有免疫抑制或者调节能力的CD4+T细胞。有研究表明Treg细胞可通过穿孔素途径和颗粒酶途径对活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD14+单核细胞以及成熟/未成熟的树突状细胞发挥细胞毒作用,而上述靶细胞的过度活化是HLH免疫病理损伤过程的中心环节。因此,有研究者推测Treg细胞在HLH的发病机制中起着一定的作用,但目前尚未得到研究证实。　　酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是检测细胞因子的经典方法,目前sCD163和sCD25水平的检测用于HLH的诊断仅限于有一定实验条件的医院中。ELISA技术一般要收集一定量的标本后再统一进行,并且结果的获取也需要一定的时间,不利于HLH的及时诊断。相比ELISA而言,流式细胞术具有操作简便、快速准确、所需样本量少的优点,目前已广泛应用于临床。因此,本研究应用流式细胞术检测EBV感染患儿细胞膜表面CD163、CD25的表达,应用ELISA检测血清中相应sCD163、sCD25的水平,分析膜形式和可溶性形式之间的关系,并探讨其与患儿临床表现、疗效及预后之间关系。　　目的：　　检测不同感染状态下患儿细胞膜表面CD163、CD25的表达,血清铁蛋白、sCD163、sCD25的水平;分析CD163、CD25的膜形式和可溶性形式之间的关系;探讨以上免疫活化指标与HLH患儿临床表现、疗效检测及预后评估之间的关系。　　方法：　　将研究对象分成一般感染组、重症感染组、IM组和HLH组,检测各组血清铁蛋白、CD163和CD25的水平。　　1、血清铁蛋白水平检测　　1.1、标本采集:所有患儿标本在入院时采集,干燥管收集外周静脉血1ml,注意避免溶血。　　1.2、分离血清:收集的血标本离心,3000rpm/min×15min,吸取上层血清,将血清等分装于ep管中,放于-80℃冰箱保存,注意避免反复冻融。　　1.3、检测血清铁蛋白:待收集一定血清标本后利用雅培公司的全自动化学发光免疫分析仪检测血清铁蛋白水平。　　2、单核细胞膜CD163和淋巴细胞亚群CD25的表达率检测　　2.1、标本采集:所有患儿标本在入院时采集,EDTA管收集外周静脉血1ml。　　2.2、细胞的荧光抗体标记　　对照管:CD45-Percp/IGG1-FITC/IGG1-PE/IGG1-APC　　单核细胞:CD45-Percp/CD14-FITC/CD163-PE　　淋巴细胞亚群:CD45-Percp/CD19-FITC/CD25-APCCD45-Percp/CD3-PE/CD25-APCCD45-Percp/CD3-PE/CD4-FITC/CD25-APCCD45-Percp/CD3-PE/CD8-FITC/CD25-APC　　2.3、流式细胞术分析单核细胞膜CD163和淋巴细胞亚群CD25的表达率　　采用FACSCanto流式细胞仪分析,联合细胞表面的标记抗原,分析CD14+单核细胞表面CD163的表达率;分析CD19+B淋巴细胞、CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞表面CD25的表达率。　　3、血清sCD163和sCD25水平检测　　3.1、标本采集:所有患儿标本在入院时采集,干燥管收集外周静脉血1ml。　　3.2、分离血清:收集的血标本离心,3000rpm/min×15min,吸取上层血清,将血清等分装于ep管中,放于-80℃冰箱保存,注意避免反复冻融。　　3.3、血清sCD163和sCD25水平检测:待收集一定数量标本后用ELISA法检测血清sCD163和sCD25水平。　　4、统计学方法　　所有数据采用SPSS17.0统计软件分析,用Kolmogorov-Smirnov正态性检验,正态分布资料用均数±标准差(—x±s)表示,采用两独立样本的t检验,两变量间的相关分析用Pearson相关分析;偏态分布资料用中位数(范围)表示,采用Mann-Whitney秩和检验,两变量间的相关分析用Spearman相关分析。当P<0.05时,认为有统计学意义。　　结果：　　1.铁蛋白水平、sCD163水平、sCD25水平与性别、年龄均无显著相关性(P>0.05)。　　2.一般感染组、重症感染组、IM组、HLH组的血清铁蛋白水平(中位数)分别为113ug/L、1128ug/L、176ug/L、31287ug/L。HLH组血清铁蛋白水平远高于一般感染组(P=0.000)、重症感染组(P=0.002)、IM组(P=0.000),差异有统计学意义。　　3.本研究8例HLH患儿血清铁蛋白水平均>3000ug/L,其中5例>10000ug/L,3例高于化学发光法检测上限40000ug/L;经HLH-2004方案治疗后好转的患儿血清铁蛋白平均水平(23862ug/L)低于死亡组的平均水平(29917ug/L)。3例HLH患儿血清铁蛋白的动态变化:第一周经按照HLH-2004方案予化疗后铁蛋白水平均明显下降了,在随后的3周时间里呈平缓下降的趋势;其中一例在治疗第5周时合并真菌性肺炎,此时血清铁蛋白水平由709ug/L回升到4372ug/L。　　4.EBV感染患儿血清铁蛋白与主要实验室数据相关性分析结果显示:血清铁蛋白水平与异型淋巴细胞比例、单核细胞比例和ALT均无显著相关性(P>0.05);血清铁蛋白水平与EBV-DNA负载量(r=0.489,P=0.001)、淋巴细胞比例(r=0.341,P=0.011)、AST(r=0.307,P=0.027)和LDH(r=0.327,P=0.019)呈正相关;血清铁蛋白与白细胞计数(r=-0.358,P=0.007)、中性粒细胞计数(r=-0.407,P=0.002)、血红蛋白(r=-0.349,P=0.009)和血小板计数(r=-0.407,P=0.002)呈负相关。　　5.一般感染组、重症感染组、IM组、HLH组血清sCD163水平分别为4190±1733ng/mL、6859±2079ng/mL、7212±5814ng/mL、28369±6254ng/mL。HLH组血清sCD163水平远高于一般感染组(P=0.000)、重症感染组(P=0.015)、IM组(P=0.000),差异有统计学意义。　　6.经HLH-2004方案治疗后好转的患儿血清sCD163平均水平(27837ng/mL)低于死亡组的平均水平(31552ng/mL)。3例HLH患儿血清sCD163水平动态变化:第一周经按照HLH-2004方案予化疗后sCD163水平均明显下降了,在随后的3周时间里呈平缓下降的趋势。;其中一例在治疗第5周时合并真菌性肺炎,此时血清sCD163水平(3125ng/mL)虽仍呈下降趋势,但下降幅度较前减小。　　7.EBV感染患儿血清sCD163与主要实验室数据相关性分析:血清sCD163水平与异型淋巴细胞比例、淋巴细胞比例、单核细胞比例、ALT和AST均无显著相关性(P>0.05);血清sCD163水平与EBV-DNA负载量(r=0.456,P=0.003)、乳酸脱氢酶(r=0.301,P=0.032)和血清铁蛋白(r=0.853,P=0.000)呈正相关;血清sCD163水平与白细胞计数(r=-0.361,P=0.001)、中性粒细胞计数(r=-0.441,P=0.001)、血红蛋白(r=-0.372,P=0.005)和血小板计数(r=-0.378,P=0.004)呈负相关。　　8.一般感染组、重症感染组、IM组、HLH组外周血CD14+单核细胞表面CD163表达率分别为34.4%±15.0%、42.8%±22.1%、37.2%±19.1%、44.9%±33.6%。HLH组CD163表达率与一般感染组(P=0.245)、重症感染组(P=0.893)、IM组(P=0.529)无明显差异。2例HLH患儿CD163表达率呈逐渐增高趋势;而1例CD163表达率为82.1%的HLH患儿病情发展凶猛,迅速死亡。　　9.一般感染组、重症感染组、IM组、HLH组血清sCD25中位数水平分别为1725pg/mL、2218pg/mL、3239pg/mL、6530pg/mL。HLH组血清sCD25水平远高于一般感染组(P=0.000)、IM组(P=0.006),差异有统计学意义;但与重症感染组无明显差异(P=0.354)。　　10.本研究8例HLH患儿中3例血清sCD25水平>10000ng/mL,1例>20000ng/mL;经HLH-2004方案治疗后好转的患儿血清sCD25平均水平(7446pg/mL)低于死亡组的平均水平(12165pg/mL)。3例HLH患儿血清sCD25水平的动态变化:第一周经按照HLH-2004方案予化疗后sCD25水平均明显下降了,在随后的3周时间里呈平缓下降的趋势;其中1例患儿在治疗第5周时合并真菌性肺炎,检测发现血清sCD25水平从第四周开始就已经增高(5081pg/mL),在第五周时已达到初诊水平(5786pg/mL)。　　11.EBV感染患儿血清sCD25与主要实验室数据相关性分析结果显示:血清sCD25水平与异型淋巴细胞比例、单核细胞比例、白细胞计数、ALT、AST和LDH水平均无显著相关性(P>0.05);血清sCD25水平与EBV-DNA负载量(r=0.436,P=0.005)、淋巴细胞比例(r=0.371,P=0.005)、血清sCD163(r=0.476,P=0.000)和血清铁蛋白(r=0.434,P=0.001)呈正相关;血清sCD25水平与中性粒细胞计数(r=-0.313,P=0.021)、血红蛋白(r=-0.442,P=0.001)和血小板计数(r=-0.332,P=0.013)呈负相关。　　12.一般感染组、重症感染、IM组、HLH组外周血CD19+B淋巴细胞表面CD25表达率分别为1.9%、1.5%、1.8%、2.3%;CD3+T淋巴细胞表面CD25表达率分别为3.9%±1.2%、5.3%±3.1%、2.8%±1.2%、8.7%±3.9%;CD3+/CD4+T淋巴细胞表面CD25表达率分别为7.4%±2.0%、10.6%±5.2%、6.8%±1.8%、9.0%±4.3%;CD3+CD8+T淋巴细胞表面CD25表达率分别为0.7%、1.7%、0.7%、0.6%。HLH组各淋巴细胞亚群CD25表达率与一般感染组(P=0.466;0.541;0.234;0.621)、重症感染组(P=0.699;0.640;0.649;0.537)、IM组(P=0.655;0.124;0.160;0.325)均无明显差异。　　13.IM患儿血清sCD163与单核细胞表面CD163表达率、血清sCD25水平与淋巴细胞各亚群的CD25表达率均无明显相关性(P>0.05)。　　全文结论：　　1.在HLH患儿中血清铁蛋白常>2000ug/L,提高临床血清铁蛋白的检测上限有利于对HLH疾病的诊断及病情分析;血清铁蛋白水平>3000ug/L的EBV感染患儿需警惕并发HLH。　　2.血清sCD163水平>10000ng/mL可作为HLH的诊断指标之一。　　3.血清sCD25可及早反映感染患儿体内炎症反应程度。　　4.EBV感染患儿的血清铁蛋白水平、血清sCD163水平和血清sCD25水平与临床严重程度呈正相关;HLH患儿血清铁蛋白水平>10000ug/L和(或)血清sCD163水平>30000ng/mL和(或)血清sCD25水平>20000pg/mL者病情进展凶猛,需及早予以治疗。　　5.动态观察HLH患儿血清铁蛋白水平、血清sCD163水平和血清sCD25水平变化,可以评估治疗效果和了解病情变化。　　6.单核细胞表面CD163表达率和淋巴细胞亚群CD25表达率在HLH疾病早期就异常升高者临床表现严重,病情进展凶猛,预后不佳,需及早予以治疗。