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约翰氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)是耐冷菌,可在相对较低的温度条件下生长并保持一定生物降解活性,能转化和去除低温水体中的污染物,对寒冷地区富营养化水体及生活污水的治理有重要意义。目前,国内外对该菌绝大多数的研究主要集中在其对污染物的生物降解特性方面,而对其冷适应机制方面的研究较少。冷休克蛋白(cold shock protein,Csp)是微生物抵抗低温环境的重要因素,其在细胞中的作用是微生物冷适应机制之一。本试验以约翰氏不动杆菌DBP-3菌株为研究对象,利用比浊法绘制该菌株在不同培养温度条件下的生长曲线,同时建立其在不同温度下生长速率与温度关系的Arrhenius曲线,以确立本研究中的冷诱导温度。利用NCBI、Universal Protein数据库筛选约翰氏不动杆菌中的冷休克蛋白基因,通过PCR和测序对相关基因进行鉴定。利用shotgun-LTQ分析冷诱导后差异表达蛋白,并采用实时定量荧光PCR检测不同冷休克蛋白基因在冷诱导后的m RNA水平差异,确定关键冷休克蛋白。制备关键冷休克蛋白的多克隆抗体,并通过Western Blot检测冷诱导后关键冷休克蛋白的表达情况。同时,利用MEGA 6.0软件构建该菌株及其他不同细菌的冷休克蛋白氨基酸序列的系统发育树,对其进行系统发育分析。将约翰氏不动杆菌的关键冷休克蛋白过表达于大肠杆菌,通过检测其在低温条件下的生长情况,对该蛋白的抗低温效应进行验证。对约翰氏不动杆菌在不同温度条件下的生长特性的研究结果表明,其最适生长温度为25.0°C,在5.0°C时仍能缓慢生长,在5.0°C至10.0°C温度区间内,温度变化对其生长速率影响最为明显,因此以7.5°C为冷诱导温度。基于细菌冷休克蛋白基因保守序列的基因筛选结果表明,在约翰氏不动杆菌中存在7个csp基因;冷诱导1 h后,约翰氏不动杆菌表达出大小为7 k D的蛋白质,shotgun-LTQ鉴定此蛋白为Csp3或Csp4。此外,q RT-PCR结果显示,csp3和csp4的m RNA水平在7.5°C冷诱导1 h后显著提高(p<0.001)。制备出Csp3和Csp4的多克隆抗体,抗体特异性较高,利用该抗体通过免疫印迹检测约翰氏不动杆菌冷诱导后Csp蛋白表达情况,结果显示,对照组中Csp3和Csp4均未表达,而冷诱导后Csp3和Csp4均表达。系统发育分析表明,Csp3和Csp4蛋白均属于Csp E家族;将Csp3和Csp4表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,发现Csp4的表达能够促使大肠杆菌在7.5°C恢复生长。以上研究表明,Csp4(Csp E)在约翰氏不动杆菌DBP-3的耐低温中可能发挥着重要作用,该结果为约翰氏不动杆菌的低温应用乃至微生物的抗低温机制研究提供了一定的理论基础。