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目的:通过观察体外新生大鼠缺氧缺血性损伤模型,了解海马神经元的损伤情况,以及损伤后不同时间点及各组间细胞自噬变化和Ca-A/K通道亚基情况,探讨自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)对自噬调节及对细胞存活的影响,并初步研究缺氧缺糖后Ca-A/K通道亚基变化与自噬的关系。方法:采用新生24小时以内的SD(Sprague Dawley)大鼠进行海马细胞原代培养,行氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)的处理方法,模拟神经元缺氧缺血模型。选取氧糖剥夺后0h、6h、12h、24 h、48 h、72 h、96 h七个时间点,通过Western blot及RT-q PCR法测定氧糖剥夺前后海马神经元自噬相关蛋白(LC-3、Beclin-1)、m RNA的变化和Ca-A/K通道亚基(Glu R1、Glu R2、Glu R3)的蛋白变化;透射电镜下检测自噬的特异性结构;用CCK8法检测细胞活性,采用Fluo-3AM流式检测缺氧缺血后[Ca2+]i的水平变化,应用自噬抑制剂3-MA干预后,行上述检测,初步探讨自噬和Ca-A/K通道的关系及可能机制。结果:1、电镜结果显示,相比正常条件下的神经元,缺氧缺糖后神经元细胞浆内有大量自噬体形成;预先采用3-MA干预的细胞组也有自噬体形成,但比缺氧缺糖组明显降低。2、RT-q PCR结果显示,与对照组相比,缺氧缺糖组0.5h和1h组LC3、Beclin-1均表达上升,缺氧缺糖0.5h组在0h表达就开始上升,48h达到高峰后开始下降。缺氧缺糖1h组则72h达到高峰后下降,且比缺氧缺糖0.5h组表达量增高;3-MA干预1h组则在模型后6h就呈现下降,12h趋向正常水平。3、Western blot结果发现,与对照组相比,缺氧缺糖0.5h组和1h组LC3、Beclin-1均表达升高,缺氧缺糖0.5h组在6h达到高峰,48h后开始下降。缺氧缺糖1h组则12h达到高峰后呈现下降趋势;且比缺氧缺糖0.5h组表达增强,3MA干预1h组在6h后呈现下降趋势;缺氧缺糖1h组的Glu R1、Glu R3在缺氧缺糖后6h表达上升,持续到24h后下降,而Glu R2则在6h表达下降,持续到24恢复正常水平。4、CCK8结果显示,缺氧缺糖损伤恢复正常条件24h后细胞存活率为71±1%,48h存活率为80±4%,相应的在每个时间点给予3-MA预处理后细胞存活率分别为75±5%、82±4%,无显著性差(p>0.05)。结论:1.成功培养了原代海马细胞并建立了体外缺氧缺血模型。2.缺氧缺糖后自噬标记蛋白LC-3、Beclin-1及Ca-A/K通道亚基Glu R1、Glu R2、Glu R3的表达发生变化。3.在一定程度损伤内,细胞自噬会随缺氧缺糖时间延长而增加。4.3-MA可影响上述自噬相关蛋白在缺氧缺糖中的表达,抑制自噬减轻细胞损伤。5.缺氧缺糖损伤后,Ca-A/K通道发生结构改变,提示形成以Glu R2亚基减少为主的新通道,介导Ca2+的快速内流,诱导细胞自噬。