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目的:课题组前期以脯氨酰顺反异构酶Pin1在肝癌发生、发展和治疗的分子机制研究为方向,进行了肝癌细胞株Pin1 RNAi和靶向Pin1的miRNA筛选的研究。为了进一步研究miR-140-5p靶向Pin1对肝细胞癌的影响,本课题在细胞水平以肝癌细胞株Huh7、PLC/PRF/5为研究对象,检测miR-140-5p靶向调控Pin1对肝癌细胞生长侵袭转移的影响;在裸鼠致瘤模型中探讨在体内miR-140-5p靶向Pin1抑制肝癌生长的潜能;在肝癌临床标本中,研究miR-140-5p低表达与Pin1高表达的临床相关性。本研究将发现miR-140-5p/Pin1信号是肝脏致癌的新机制,同时且为肝癌及其他癌症的诊断治疗提供新靶标。方法:(1)包装过表达miR-140-5p和敲减Pin1的慢病毒,感染Huh7、PLC/PRF/5细胞株,筛选建立稳转株。(2)利用相差显微镜观察过表达miR-140-5p和敲减Pin1后细胞形态的变化,Western blot检测Pin1及EMT相关蛋白的变化。(3)观察过表达miR-140-5p、过表达mi R-140-5p后恢复Pin1、敲减Pin1及敲减Pin1联合过表达miR-140-5p对肝癌细胞株Huh7、PLC/PRF/5生物学行为的影响:MTT法检测细胞增殖能力;transwell实验检测细胞迁移侵袭能力;细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力的改变。(4)Western blot检测过表达miR-140-5p、过表达miR-140-5p后恢复Pin1、敲减Pin1后周期蛋白、NF-kB、PI3K/Akt通路和Ras-Raf-MEK-ERK通路关键蛋白的变化。(5)裸鼠致瘤模型研究体内miR-140-5p靶向Pin1抑制肝癌生长的能力。(6)肝癌细胞株和临床标本中,QPCR检测mi R-140-5p表达,Wesern blot检测Pin1蛋白的表达,GraphPad Prism 5软件分析miR-140-5p低表达与Pin1高表达的临床相关性。结果:(1)成功构建了过表达miR-140-5p的肝癌细胞株:a.过表达miR-140-5p的Huh7细胞中miR-140-5p的表达量是正常细胞的60多倍;b.细胞中Pin1蛋白表达受到显著抑制mRNA表达无显著变化。(2)过表达miR-140-5p与敲减Pin1后细胞均发生了明显的MET表型变化,Western blot检测Pin1显著下调,上皮标记物E-cadherin表达明显上调,间质标志物vimentin表达明显下调。(3)过表达mi R-140-5p显著地抑制细胞增殖、侵袭转移、克隆形成能力;过表达mi R-140-5p细胞回补Pin1后细胞侵袭转移能力完全恢复,增殖和克隆形成能力部分恢复。(4)敲减Pin1得到与过表达miR-140-5p一致的变化,细胞增殖能力、侵袭转移能力、克隆形成能力都被显著地抑制,且敲减Pin1后过表达miR-140-5p并没进一步增强miR-140-5p的抑癌能力。(5)mi R-140-5p靶向Pin1显著抑制依赖于Pin1的多条癌症相关信号通路蛋白表达。(6)过表达miR-140-5p显著抑制了裸鼠体内肝细胞癌的生长能力。(7)在肝癌细胞株和临床标本中miR-140-5p通常低表达,Pin1通常高表达,且其表达水平呈显著的负相关。结论:miR-140-5p可通过靶向Pin1并同时阻断依赖于Pin1的多条癌症相关信号通路来发挥抑制肝癌的作用,进一步揭示肝癌发生发展的新机制,有望为肝癌的诊断治疗提供新靶标。