1目的通过临床队列研究、数据挖掘研究及体外实验三部分观察安徽省中医院风湿科治疗强直性脊柱炎(AS)的药物、血小板参数的变化、炎症免疫反应及新风胶囊(XFC)改善血小板参数、炎症免疫指标,并探讨XFC通过SDF-1/CXCR4-VEGFA通路改善血小板活化及炎症反应的机制。2方法2.1临床队列研究电话随访2012年1月-2016年6月本院AS住院患者,出院后服用中成药和中药汤剂的时间及种类,录入数据。根据服药时间,定义暴露组。调取AS患者方药应用数据,统计口服中成药、中药汤剂的使用情况,及各暴露组终点事件发生情况,采用卡方检验、多元回归分析各因素与终点事件发生的关系。2.2数据挖掘研究从安徽省中医院临床数据中心,调取2012年6月-2017年7月安徽省中医院风湿科治疗有效住院的AS患者的电子病历资料共1110例。采集住院病人的一般情况,前20味中药及新风胶囊使用情况,血小板参数及免疫炎症指标等。依据是否合并使用XFC,将患者分为健脾(中药+XFC+芙蓉膏)组和单纯(中药)组。采用SPSS 21.0、SPSS Clementine 11.1软件对数据进行分析。2.3体外实验研究2.3.1 XFC含药血清的制备将35只雄性SD大鼠,随机分为空白对照组、阴性对照组、高、中、低剂量(按照20倍,10倍,5倍XFC临床给药剂量区分)组。连续灌胃3天后,取血除菌备用。MTT实验检测最佳XFC剂量。2.3.2临床AS患者及健康者单核细胞(PBMCs)的分离和培养收集AS患者外周血24例及健康者6例,分为正常组,模型组,XFC组,XFC+AMD3100组及AMD3100组,按步骤分离出PBMC,加入含高糖的培养基培养,置于标准培养箱培养24h,分别于XFC组,XFC+AMD3100组及AMD3100组中加入最佳剂量XFC含药血清,XFC+AMD3100,AMD3100。再次培养24h后收集细胞。免疫荧光法检测CD62p、CD40L、PDGFA的表达;ELISA法检测IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR的表达;q RT-PCR检测SDF-1m RNA、CXCR4m RNA、VEGFAm RNA的表达;WB检测SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白的表达。3结果3.1 AS患者临床队列研究结果3.1.1健脾化湿益肾通络方药使用情况323例患者中成药服用总次数为215次,包含有10种,杜仲壮骨丸70次(32.56%);新风胶囊50次(23.26%);黄芩清热除痹胶囊19次(8.83%);雷公藤多苷片15次(6.98%);颈椎活血胶囊10次(4.65%);新癀片10次(4.65%);其他类41次(19.07%)。服用中成药时间为0.5~50个月,平均(10.12±12.71)个月。323例强直性脊柱炎患者口服中药汤剂总频次为556次,包括13种中药汤剂,四妙散152次(27.34%);独活寄生汤92次(16.55%);身痛逐瘀汤66次(11.87%);桃红四物汤53次(9.53%);宣痹汤23次(4.14%);防风汤20次(3.60%);二陈汤11次(1.98%);其他类139次(25.00%)。应用中药汤剂时间为0.25~50个月,平均(7.93±11.88)个月。3.1.2各暴露组健脾化湿益肾通络药应用频次323例AS患者应用健脾化湿药共716次,其中非暴露组116次,低暴露组159次,中暴露组90次,高暴露组351次;祛风益肾药共405次,其中非暴露组69次,低暴露组83次,中暴露组48次,高暴露组205次;活血通络药共726次,其中非暴露组125次,低暴露组156次,中暴露组101次,高暴露组344次。3.1.3终点事件与健脾化湿益肾通络方药治疗的相关性随访患者中发生再发入院4例,其中非暴露组2例,低暴露组1例,中暴露组1例;非暴露组关节外病变1例;低暴露组手术治疗1例;无全因死亡。经χ2检验,暴露强度与终点事件的发生差异有统计学意义(P<0.05)。经Logistic回归模型可见,暴露强度、陈皮、桑寄生、威灵仙因素P<0.05,B<0且OR值<1。3.2 AS患者数据挖掘研究结果3.2.1治疗AS的核心处方通过复杂网络技术分析,治疗AS的核心处方为:薏苡仁、茯苓、山药、陈皮、甘草、威灵仙、豨莶草、泽泻、丹参、鸡血藤、桃仁、红花、蒲公英、白花蛇舌草、杜仲、狗脊。3.2.2治疗AS的中药使用情况调取治疗AS患者使用频次前20味中药,主要可分为以下4类:健脾化湿药(31.61%),活血通络药(26.69%),祛风除湿药(20.09%),益肾清热药(21.61%)。3.2.3聚类分析治疗AS的中药配伍情况选取欧式距离为20时,常用中药配伍为4组:第1组为桃仁,红花,丹参,陈皮,薏苡仁,威灵仙,山药,蒲公英;第2组包括茯苓,泽泻,豨莶草;第3组有杜仲,狗脊;第4组含白花蛇舌草,独活,伸筋草,鸡血藤。3.2.4 AS患者血小板参数情况PLT与正常参考值相比,升高579例(52.16%),正常505例(45.5%),降低26例(2.34%)。PCT与正常参考值相比,升高643例(57.93%),正常454例(40.9%),降低13例(1.17%)。PDW与正常值相比,升高102例(9.19%),正常788例(70.99%),降低220例(19.82%)。MPV与正常值相比,升高208例(18.74%),正常645例(58.11%),降低257例(23.15%)。3.2.5血小板参数与AS患者炎症免疫指标的相关性分析相关性分析结果示:PLT与ESR成正相关;PLT与CRP、C4成正相关;PCT与ESR、Ig G成正相关。PLT的回归分析结果示:CRP的P<0.01,OR>1;C4的P<0.05,OR>1;PCT的回归分析结果示:ESR的P<0.05,OR>1;Ig G的P<0.01,OR>1。3.2.6血小板参数与炎症免疫指标的关联分析与PLT上升关联度较高(置信度>60%,支持度>20%,提升度>1)五项指标,分别为CRP上升,C4上升,ESR上升,Ig G上升,C3上升。与PCT上升关联度较高(置信度>60%,支持度>20%,提升度>1)五项指标,分别为ESR上升,CRP上升,C4上升,Ig G上升,C3上升。3.2.7 AS患者的一般情况依据是否用健脾单元疗法(中药+XFC+芙蓉膏)治疗,将检索治疗有效的1110例AS患者,分为健脾组435例,其中,男性287例,女性148例,平均年龄35.79±10.99岁,平均住院时长17.56±10.42天;单纯组490例,男性302例,女性188例;平均年龄34.80±10.19岁,平均住院时长16.75±8.15天。3.2.8健脾组及单纯组治疗前、后实验室指标的情况治疗后,健脾组PLT、ESR、CRP、Ig G、C3、C4指标下降明显,PCT、Ig A指标下降;单纯组PLT、ESR、CRP、C3指标下降明显,PCT、Ig A、Ig G、C4指标下降;两组间治疗后比较,健脾组PLT、PCT、ESR、CRP、C3下降更显著。3.2.9健脾单元疗法药物与指标的关联分析置信度>60%,支持度>20%且提升度>1。新风胶囊&茯苓&陈皮与PLT下降关系紧密,新风胶囊&茯苓&丹参与CRP下降关系紧密,新风胶囊&蒲公英&威灵仙与ESR下降关系紧密,新风胶囊&茯苓&薏苡仁与PCT下降关系紧密,新风胶囊&茯苓&丹参与C4下降关系紧密,新风胶囊&杜仲&山药与MPV上升关系紧密,山药&蒲公英&桃仁与PDW上升关系紧密,泽泻&威灵仙&杜仲与Ig A下降关系紧密。3.2.10随机行走评价两组治疗后实验室指标情况采用随机行走模型评健脾组和单纯组AS患者血小板参数PLT、PCT,免疫炎症指标C4、ESR、CRP的影响。两组患者PLT每改善一分,需要行走5.89、10.36步;PCT每改善一分,需要行走5.36、6.79步;C4每改善一分,需要行走1.77、1.88步;ESR每改善一分,需要行走2.95、3.01步;CRP每改善一分,需要行走2.37、2.83步;或者每正向行走一步,PLT综合改善率分别为16.99%、9.66%;PCT综合改善率分别为18.64%、14.72%;C4综合改善率分别为56.59%、53.19%;ESR综合改善率分别为33.85%、33.20%;CRP综合改善率分别为42.24%、35.28%。3.3体外实验研究结果3.3.1 AS患者及健康者的一般情况安徽省中医院风湿免疫科AS患者外周血标本24例。男女各12例;平均年龄为31.66±8.76岁。正常组标本来自本院体检中心正常体检者6例,男女各3例;平均年龄为29.79±9.69岁。3.3.2 MTT实验:XFC对PBMCs抑制作用的影响与同期空白对照组相比,中、高剂量XFC组吸光度(A)下降,中剂量XFC组A降低明显(P<0.01,P<0.05),各剂量XFC组对PBMC的抑制作用在培养24h后抑制作用逐渐增强,而在48h,抑制作用较24h均有所下降。3.3.3血小板活化指标与SDF-1/CXCR4-VEGFA通路及细胞因子的相关性血小板活化指标CD62p与IL-1β、TNF-α、VEGFA、VEGFR、SDF-1、CXCR4成正相关,与IL-10成负相关;CD40L与IL-1β、TNF-α、VEGFA、VEGFR、SDF-1成正相关,与IL-10成负相关;PDGFA与IL-1β、TNF-α、VEGFA、VEGFR、SDF-1、CXCR4成正相关,与IL-10成负相关。(P<0.01)3.3.4各细胞中CD62p、CD40L、PDGFA的表达与正常组相比,模型组CD62p、CD40L、PDGFA表达增加;与模型组相比,XFC组CD62p、CD40L、PDGFA表达降低;与XFC组相比,AMD3100组及XFC+AMD3100组CD62p、CD40L、PDGFA降低明显;与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组CD62p、CD40L、PDGFA降低更显著。(P<0.05,P<0.01)3.3.5各组细胞因子的表达与正常组相比,模型组外周血单核细胞中IL-1β、TNF-α明显升高,IL-4、IL-10明显降低;与模型组相比,XFC组、AMD3100组、XFC+AMD3100组IL-1β、TNF-α降低,IL-4、IL-10升高;与XFC组相比,AMD3100组、XFC+AMD3100组IL-1β、TNF-α降低明显,IL-10升高明显;与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组IL-1β、TNF-α降低更明显,IL-4、IL-10升高更明显。(P<0.05,P<0.01)3.3.6各组血小板活化指标及血管内皮生长因子的表达与正常组相比,模型组CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR明显升高;与模型组相比,XFC组、AMD3100组、XFC+AMD3100组CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR降低;与XFC组相比,AMD3100组、XFC+AMD3100组CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR降低明显;与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组CD62p、CD40L、VEGFA、VEGFR降低更显著。(P<0.05,P<0.01)3.3.7各组SDF-1、CXCR4、VEGFA基因表达情况与正常组相比,模型组SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA表达水平明显升高;与模型组相比,XFC组、AMD3100组及XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA均降低;与XFC组相比,AMD3100组及XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA降低显著;与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA降低更明显。(P<0.05,P<0.01)3.3.8各组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白的表达与正常组相比,模型组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白表达水平明显升高;与模型组相比,XFC组、AMD3100组及XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白的表达均降低;与XFC组相比,AMD3100组、XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白表达均明显降低;与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白降低更显著。(P<0.05,P<0.01)4结论(1)健脾化湿益肾通络方药可降低患者终点事件发生的风险,长期服用可改善AS预后。(2)本院治疗AS的核心药物可归为健脾化湿药,活血通络药,祛风除湿药,益肾清热药4类。(3)AS患者存在血小板活化,且与炎症免疫反应关系密切。(4)XFC对AS患者血小板活化及炎症反应的改善起重要作用,其机制为阻断SDF-1/CXCR4-VEGFA通路,抑制血小板活化,下调IL-1β、TNF-α,上调IL-4、IL-10,减少炎症反应。(5)XFC有类似于阻断剂AMD3100的作用。