前言肿瘤是威胁人类健康的重大疾病,发病率逐年上升。在肿瘤的发生发展中会涉及多种基因的突变,因此突变基因的检测是肿瘤研究的重要课题,从而实现肿瘤的早期诊断和治疗。目前测序是检测基因的金标准,然而其耗时长价格昂贵等缺陷,不适合大规模筛查的需要,为此人们发展了相对简捷的方法进行测序前的检测。目前,常用的突变检测方法有PFLP(限制性片段长度多态性)、SSCP(单链构象多态性分析)、HA(杂合双链分析法)、ASA(等位基因特异性扩增法)、DHPLC(变性高效液相色谱)、MI(微卫星不稳定性)等,其中PCR-RFLP是一种以PCR扩增为基础进行特异性酶切从而实现对基因点突变进行检测的方法,具有操作简单并且重现性好的优点,结合电泳可有效检测突变,应用十分广泛。但常规的电泳技术灵敏度相对较低,检测的假阴性率相对较高,不能对微量的突变样品进行有效筛查。微流控芯片分析系统(microfluidic analysis system)是分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学以及生物学等多学科交叉的产物,其目的是通过分析仪器的微型化和集成化,极大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中,甚至集中到方寸大小的芯片上,因此又被称为微全分析系统(Miniaturized TotalAnalysis Systems,uTAS)或芯片实验室(Lab-on-a-chip,LOC)。微流控芯片具有样品用量少、分析速度快,灵敏度高,易于集成化自动化的特点,在生物样品的分析中有着显著的优势。微流控电泳芯片分析系统是在毛细管电泳基础上发展起来的更为优化的分析技术。其原理是以电场为驱动力,借助于离子或分子在电泳迁移或分配上的差异,从而实现对复杂试样中多种组分的分离。由于芯片的微通道面积-体积比显著增大,焦耳热能很快向四周溢散,所以可施加平板凝胶电泳难以达到的高场强,实现对样品快速、高效的分离检测。目前在芯片上已经实现了对核酸,蛋白质,氨基酸等多种生物分子的分析与分离,并有效用于多种基因突变的检测。大肠癌是发病率最高的恶性肿瘤之一,在我国已位居第3位,由于就诊时多为中晚期,导致死亡率明显增加,因此建立有效的早期检测的方法,以实现早期诊断、早期治疗是提高患者生存率的关键。大肠癌的发生与发展是一个多阶段、多个相关基因改变的累积过程,其中K-ras基因突变发生在腺瘤早期,对其检测有助于大肠癌的早期诊断。本研究拟以K-ras基因突变作为检测对象,将RFLP方法中的电泳检测过程移植于到微流控芯片上进行,建立RFLP-微流控基因突变检测系统,实现对K-ras基因突变的高效快速检测。材料与方法一、微流控电泳芯片DNA分离系统的建立1、芯片的制作用标准光刻和湿法刻蚀技术在玻璃基片上刻蚀出十字形微通道网络,采用热键合方法将其与盖片进行封接,在微通道末端粘接储液池,制成玻璃微流控芯片。2、共聚焦型激光诱导荧光检测装置的建立3、芯片通道表面的修饰。4、微流控电泳芯片DNA分离系统的优化(1)缓冲液组成成分的优化:常规选取1XTBE,2XTBE及3XTBE作为缓冲液,考察缓冲液对筛分系统的影响。(2)筛分介质场强的优化:在相同筛分浓度下,考察不同场强120V/cm、180V/cm、240V/cm对分离效能的影响;(3)筛分系统浓度的优化:在相同的180V/cm场强下,考察不同浓度筛分介质1.0%、2.0%、3.0%HPC对筛分效能的影响。二、RFLP-微流控芯片基因突变检测系统的建立1、PCR-RFLP方法考察经PCR扩增出含有密码子12位点的107bpDNA片段,利用MavⅠ限制性内切酶特异性切割目的基因。琼脂糖电泳及微流控电泳芯片的检测结果对比。2、检测系统灵敏度考察分别稀释酶切样本至50倍、100倍、200倍和300倍、400倍、500倍,600倍,微流控芯片对各浓度检测,考察芯片检测灵敏度情况。根据K-ras基因12密码子突变与否,分别按不同比例混合突变型SW480和野生型HT29细胞(1:1、1:10、1:100、1:10~3、1:10~4、1:10~5、1:10~6)利用微流控芯片检测结果,并以常规电泳为对照比较对混合细胞检测突变的限度。三、RFLP-微流控芯片基因突变检测系统的应用1、对6种大肠癌细胞系进行检测。2、对46例大肠癌患者临床样本进行检测,考察微流控芯片的筛分系统与传统电泳相比对样本的检出率。实验结果一、微流控芯片DNA分离系统的优化1、微流控芯片通道表面修饰经实验证明,经MES(pH6.1)酸性缓冲液对芯片的表面—SiOH基团的酸化处理后能有效抑制电渗流的产生,减轻谱带扩展现象,使芯片前期处理时间明显缩短。2、缓冲液组成的选择选取1XTBE,2XTBE及3XTBE作为缓冲溶液,实验证明在相同筛分介质的浓度下,随着缓冲液浓度增加分离度越好,对酶切样本检测的敏感度越提高,但缓冲液浓度增大分离时间也相应的增加,因此选取3XTBE作为缓冲液。3、筛分介质浓度的优化在相同的场强下,随筛分介质浓度的增加分离效能越好但粘滞度越大,分离时间越长,实验证明2%HPC可以达到较好的筛分效果且粘滞度小容易充入微通道。4、筛分系统场强的优化在相同的筛分浓度下,随着场强的增加其分离时间缩短,但分离度也随之下降。180V/cm的场强可在10min左右有效分离ΦX174-HaeⅢRF DNA。二、RFLP-微流控芯片基因突变检测系统的建立1、PCR-RFLP方法的考察针对K-ras基因12密码子的野生型和突变型细胞系进行PCR-RFLP反应,扩增出107bpDNA片段后进行特异性酶切,野生型细胞被完全切断为77bp和30bp,而突变型则无变化。2、微流控芯片敏感度检测稀释酶切样本,500倍时样本在微流控芯片中峰仍清晰可见,经传统电泳对比其敏感度提高500倍以上。按不同比例混合的K-ras基因12密码子突变型和野生型细胞的检测,经微流控芯片分析细胞混合比例的突变检测限度达1:10000,常规电泳仅可在1:10见一模糊条带,而测序检测限度仅为1:4。三、RFLP-微流控芯片基因突变检测系统的应用1、RFLP-微流控芯片系统对6种大肠癌细胞系的检测结果完全符合测序检测的突变类型。2、临床样本的检测:取大肠癌标本46例,经微流控芯片检测结果与测序结果一致,其中有两例大肠癌临床样本在微流控芯片检测系统中显示突变,而测序与常规电泳无显示。结论本研究采用MES(pH6.1)弱酸性缓冲液动态处理结合弱酸性基质静置动态涂层方法处理玻璃芯片,成功建立了微流控芯片DNA分离系统并实现了对ΦX174-HaeⅢRF DNA进行有效分离。RFLP-微流控芯片基因突变检测系统对K-ras基因野生/突变型混合细胞的突变检测限度可达1:10000,是常规电泳的检测限度的1000倍,测序检测的2500倍,检测灵敏度是常规电泳的500倍以上,对临床样本的突变检测特异性可达100%,为肿瘤相关基因的微量筛查及微全系统的建立提供有效的分析工具。