背景近年来，由于人口数量及流动性增加、诊治延误和抗结核药物的不规范使用，以及艾滋病等免疫缺陷病的流行，使得结核耐药日趋严重，耐多药结核（MDRTB）甚至广泛耐药结核（XDRTB）严重蔓延，严重危害社会公共卫生安全。据WHO统计数据表明，在全球22个结核及耐药结核高负担国家中中国位列第二，耐药结核感染率全球第一。对于耐药结核患者，早发现、早治疗是取得成功治疗的关键。在制定治疗方案时，最好根据药敏试验结果进行个体化治疗。对结核分枝杆菌及其耐药检测的传统方法，主要依靠痰涂片、培养、药敏、PCR技术等多项试验综合分析，方法繁琐、需时长、阳性率低、特异性差，提供的耐药信息量少；而目前基于耐药基因检测的分子生物学技术，如直接测序法、PCR-SSCP、微阵列基因芯片法等，价格昂贵，操作要求高。因此，建立新型检测结核菌耐药基因型的方法，用于快速检测耐药结核菌，对结核病早期治疗和控制耐药菌的传播具有重要意义。表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器是近年来迅速发展起来的新型光学传感器，其原理在于当光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，其对应的入射角即SPR角与金属表面结合的分子质量成正比。它具有实时、无需标记、在线分析等优势，可通过换能器，将传感器芯片表面配体与分析物作用的生物信号转换为可检测的光电物理信号，实现对样本中靶分子的检测。在传感器相关检测中以PCR为代表的核酸扩增技术常被用于提高检测限。但由于复杂的热循环过程带来的非特异性扩增、与芯片表面扩增的不兼容性以及增加的检测成本，仍然是需要考虑的问题。RCA是一种恒温的DNA扩增过程，可于短时间内在固相载体表面扩增出上千倍互补与环状模板的串联重复序列。与传统PCR相比，RCA具有无需循环控温、线性扩增、扩增产物易于固定等优势，近年来成为一种新颖的信号扩增工具用于DNA等痕量物质的超敏检测。恒温连接酶的特异性使该方法对单碱基突变有较高的敏感度和分辨率，具有链置换活性的多聚酶使该扩增反应能在恒温条件下进行，且靶序列仅作为生成环状模板的支架，避免了可能的扩增污染和潜在的生物危害。本研究结合课题组前期的研究基础，将芯片表面锚定RCA与SPR生物传感技术相整合，建立了一种新型的恒温扩增型SPR生物传感器阵列，利用自行设计的标签型锁式探针（Padlock Probe, PLP），可实现多重点突变的恒温、高通量、无标记检测。并将其运用于结核杆菌耐药相关基因突变位点的多重检测，可直接对结核杆菌核酸及其多重耐药基因的5种常见突变位点进行恒温快速检测，为结核分枝杆菌及耐药基因快速鉴定和流行病学调查等提供坚实的实验基础。方法1．利用磁珠颗粒模拟固相反应体系，根据生物配体的共价偶联将氨基修饰的寡核苷酸探针（捕获探针）固定于羧基修饰的磁珠表面构成固相反应生物敏感膜，探讨固相RCA反应的具体方式和最优反应体系。利用SRBR-Green II对液相RCA扩增体系进行荧光定量观察，以确定液相扩增反应的最佳体系。2.在前期研究基础上，对SPR生物传感器检测平台的硬件设施和软件设施进行改进，增加检测通道，改进温控和流速控制系统及分析物流通方式。对传感器芯片自组装相关方法进行改进并制备生物敏感膜。3. NCBI数据库查找针对四种临床常用一线抗结核药物的5种耐药基因主要突变位点。利于Primer Premier5.0设计包含标签序列、通用序列、两端识别序列的锁式探针（PLP），并对形成的环状探针进行二级结构预测和分析。利于Array Designer4.0软件，设计包含标签序列探针，使各探针间保持较好的一致性和特异性。探讨杂交时间、杂交温度、扩增时间等各项反应条件对SPR信号值的影响，确定芯片表面RCA反应的最佳条件。4.将纳米金信号放大与固相表面锚定RCA反应相结合，通过纳米金颗粒修饰的通用序列探针与固相表面RCA反应产物的大量串联重复序列杂交，从而产生具有强大信号放大能力的联级信号放大效果。优化纳米金信号放大系统的反应条件，并以人工合成的模式DNA分子检测该反应系统的灵敏度和特异性。5.根据GenBank找到的结核分枝杆菌16s-23s rRNA基因ITS序列，设计包含硫代磷酸化修饰的酶切位点的锁式探针，建立基于靶引物的液相RCA反应鉴定结核与非结核分枝杆菌SPR生物传感器检测方法，并实现液相RCA反应的无标记实时动态监测。6．以34例临床标本为检测对象，针对四种一线抗结核药物的五个突变位点进行MDRTB临床标本的SPR生物传感器检测，并与测序结果对照；对建立的恒温型SPR生物传感器微阵列检测方法进行方法学比较和评估，并确定临床样本检测步骤。结果1.完成以磁珠为载体的固相RCA体系构建，并确定以液相连接后固相载体表面扩增的方式进行反应。固相RCA的最佳反应体系为0.5U/μL Phi29DNA polymerase，0.2μg/μL BSA，5%DMSO，1mM dNTPs。连接产物及RCA产物电泳结果显示，仅在突变型靶序列存在条件下生成的环状模板可引发固相表面RCA反应，反之则无产物生成。2.成功构建新型恒温固相扩增型SPR生物传感器检测仪，传感器芯片为20mm x28.6mm镀金膜棱镜，检测流池为8通道串联流通池。系统温度控制范围为25℃-60℃，温控精度±0.1℃；流速范围为5-2000μL/min，流速控制精度为±1μL/min；检测池在反应中能保持稳定负压，以保证系统反应的稳定性；采用巯基末端修饰共价结合法将还原型捕获探针自组装于芯片金膜表面，探针浓度为1μM。3.利用自行设计的锁式探针可以完全分辨靶序列单碱基突变，RCA可将SPR信号值（突变位点信号）放大10.0倍，突变识别率为5000：1（野生型与突变型靶序列的浓度比）。连接产物、RCA产物、以及RCA产物HhaI酶切电泳条带位置准确，明亮清晰。自行设计的捕获探针特异性好、各探针之间具有相同的长度和相近的Tm值（<1℃），可使各探针在相同条件下杂交，适于传感器微阵列系统的多通道并行检测。检测最适液相靶序列杂交温度为45℃，芯片表面杂交温度为37℃，RCA扩增时间为30min。4.针对5种临床常见结核杆菌耐药主要突变位点：异烟肼（INH）：KatG315（AGC→ACC）, inhA-15（ACG→ATG）；利福平（PFP）：rpoB526（CAC→TAC）；乙胺丁醇（EMB）：embB306（ATG→GTG）；链霉素（SM）：rpsL43（AAG→AGG），设计包含标签型锁式探针及相应捕获探针的探针组，并实现了芯片表面各突变位点的多重扩增检测，同一突变位点对突变型和野生型靶序列的SPR信号值差异明显（p <0.01），各突变位点间交叉反应结果显示SPR信号值差异明显（p <0.01）。5．建立的纳米金信号放大系统可有效提高检测的灵敏度，直径15nm的纳米金颗粒在pH7.5和8%工作浓度下可将SPR信号值（RCA放大后）放大2.1倍，与阴性和空白对照信号值比较有显著性差异（p <0.01）。对合成靶序列的检测检测限为5X10^-12M （59.1±7.1mo），且在10-12M至10^-8M浓度范围内成线性相关（y=615.29x+1323.8, R2=0.9846）。6.建立的液相target-primed RCA SPR生物传感器检测系统，可通过两步法在4h内完成对结核分枝杆菌群复合群（MTBC）和鸟型分支杆菌群复合群（MAC）的恒温（37℃）快速检测。SPR方法对临床标本的检测结果与菌种鉴定结果一致。最低检测限分别为MTBC：4.2X10⁴CFU/mL （0.005ng/μL），MAC：3.7x10⁴CFU/mL （0.002ng/μL）；经特殊设计的锁式探针可使液相RCA反应与限制性内切酶反应同时进行，实现无标记的SPR实时动态监测RCA反应。7.采用试剂盒法和加热碱裂解法对24例临床分离株标本和10例临床分泌物样本提取基因组DNA结果显示，碱裂解法操作简便，对临床分泌物标本和临床分离株均有较好的提取效果，可作为样本的前处理方法。SPR传感器方法检测34例临床标本，检测限为8.2pg/μL （65.7±8.5mo）临床标本基因组DNA，临床灵敏度和特异性与测序方法比较分别katG315：92%和80%；inhA-15：100%和100%；rpoB526：94.4%和100%；embB306：95%和100%；rpsL43：100%和100%。经Kappa检验两种方法检测结果具有较好的一致性性差异（p <0.05, Kappa>0.75）。结论1.新型恒温扩增型SPR生物传感器，改变了普通高灵敏性传感器检测对PCR方法的依赖。其稳定密闭的检测系统和简单低耗能的操作，有利于传感器的小型化和便携性。2.自行设计的标签型锁式探针，不仅可在高背景干扰下识别突变靶序列，还可实现混合靶序列的多重连接反应。其包含的标签序列，可实现芯片表面的多重固相扩增反应，且反应条件一致，交叉反应小，增加了传感器微阵列的检测通量。3.纳米金信号放大系统可显著增加SPR芯片表面的等离子共振强度，有效提高传感器的检测灵敏度，为SPR生物传感器的痕量物质检测提供了一种可靠的信号放大方法，在核酸非扩增快速检测及生物传感器领域有较大的应用潜力。4.基于靶引物的液相RCA型SPR生物传感器检测系统，在保证特异性与敏感性的基础上，可快速恒温地实现对液相扩增反应的无标记实时动态监测，为核酸扩增检测提供了一条新思路。5.构建的新型SPR生物传感器检测系统，可在4小时内同时检测五种临床常见MDRTB耐药突变位点，检测方法具有灵敏、特异、操作简单、快速的特点。与传统基因芯片相比，极大降低了技术、设备要求和检测成本。为临床结核杆菌耐药的恒温快速检测乃至其他基因检测提供一种新方法新思路，有望弥补现有常规检测方法存在的不足，满足临床快速诊断的需求，具有广阔的应用前景。