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防御素(Defensin)是一种具有广谱抗微生物、抗肿瘤和调节免疫功能的阳离子多肽,广泛分布于多种生物类群中。由于其独特的生物作用机制,被认为是抗生素药物的替代品之一。目前绵羊体内鉴定有两种β-防御素,即β-防御素-1、-2(Sheepβ-defensin-1、-2,SBD-1、SBD-2),SBD-2仅在舌及回肠中表达,SBD-1在呼吸道和消化道中都有表达。已有研究证实益生性酿酒酵母菌能促进绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的表达,而诱导绵羊瘤胃外植体内SBD-1表达的研究尚未见报道。绵羊瘤胃外植体保留了一定程度上的组织学特点,作为诱导对象,其可以模拟绵羊的瘤胃环境。本试验目的是研究益生性酿酒酵母菌及其灭活菌对绵羊瘤胃外植体内SBD-1表达的影响,并初步探究可能介导这一过程的信号通路。参照本课题组已经建立的绵羊瘤胃外植体培养方案,进行外植体的培养。将不同浓度(104、105、106、107、108、109 CFU·mL-1)的酿酒酵母菌及其灭活菌与外植体共培养24 h后,通过qPCR和ELISA方法检测瘤胃外植体内SBD-1 mRNA和蛋白的表达变化,以分别确定活菌及其灭活菌诱导SBD-1表达最高的菌液浓度;然后用该浓度的活菌及其灭活菌对瘤胃外植体进行不同时间(2、4、8、12、16、20、24 h)的刺激,同样用qPCR和ELISA方法检测瘤胃外植体内SBD-1 mRNA及蛋白的表达变化,从而筛选出活菌及其灭活菌诱导SBD-1表达的最佳时间。结果表明益生性酿酒酵母菌及其灭活菌均能促进绵羊瘤胃外植体内SBD-1的表达,且活菌浓度为107 CFU.mL-1、灭活菌浓度为108 CFU.mL-1分别诱导16h时,绵羊瘤胃外植体内的SBD-1的表达量分别达到最大。采用qPCR方法检测酿酒酵母灭活菌刺激后绵羊瘤胃外植体内信号通路各因子的(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、ERK1/2、JNK)mRNA 相对表达量,以确定核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)是否参与信号转导。选取NF-κB通路特异性抑制剂PDTC和MAPK通路三种特异性抑制剂SB202190、PD98059和SP600125(分别抑制p38、ERK1/2和JNK途径)对绵羊瘤胃外植体预处理后,以最佳诱导条件的酿酒酵母灭活菌刺激诱导外植体,qPCR方法检测外植体内SBD-1 mRNA表达情况,以确定两条通路的参与情况。结果表明酿酒酵母灭活菌刺激诱导外植体后信号通路各因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、ERK1/2、JNK)mRNA 的相对表达量均有不同程度的上升。对绵羊瘤胃外植体施加抑制剂(PDTC、SB202190、PD98059和SP600125)预处理,再用酿酒酵母灭活菌刺激诱导外植体后,绵羊瘤胃外植体内SBD-1 mRNA相对表达量均有所下降,其中p38-MAPK通路受抑制后外植体内SBD-1 mRNA相对表达量下降最多。因此,NF-κB和MAPK信号通路均参与诱导过程中的信号转导,可能以MAPK通路中p38途径为主要通路。