研究背景:前列腺癌（PCa）是男性第二大常见肿瘤,也是导致癌症相关死亡的主要原因之一。雄激素剥夺疗法（ADT）抑制雄激素的产生或阻断雄激素受体（AR）信号,在治疗转移性（晚期）前列腺癌和预防前列腺癌复发方面具有疗效。然而,大多数患者会出现药物抵抗,最终发展为雄激素非依赖型去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。在这种情况下,患者中位生存期只有18个月左右。新型雄激素信号通路抑制剂,包括恩杂鲁胺和阿比特龙,虽然能够缓解这些患者的病情发展,但这些抑制剂仅能延长寿命约2-3个月。因此,CRPC仍是一种具有临床挑战性的晚期癌症,需要阐明更多的分子机制和细胞特征来寻找新的生物标志物以及风险分层,有助于开发新的治疗方法来延长生存期。含CUB结构域蛋白1（CDCP1）是一种I型跨膜糖蛋白,含有三个细胞外CUB结构域,是SRC激酶家族的底物。这种蛋白也被称为gp140、CD318、SIMA135或Trask。它经常在多种人类癌症中过度表达,其中包括前列腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、肝细胞癌、慢性髓系白血病（CML）和急性髓系白血病（AML）等。同时,这种过度表达与各种恶性肿瘤患者的不良预后相关。CDCP1蛋白通过调控下游络氨酸磷酸化依赖的细胞信号通路水平,如PI3K/Akt、PKCδ、SRC和ERK/MAPK等,在促进肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。在PCa细胞中,CDCP1基因的表达通常被雄激素抑制,并保持在一个相对较低的水平。然而,在CRPC中,雄激素剥夺过程导致了 CDCP1蛋白水平的上调,以及相应的Akt和SRC/MAPK信号通路的激活,说明CDCP1蛋白的表达水平变化可能与CRPC的进展有潜在关联。因此表征CDCP1基因转录激活的机制和CDCP1蛋白所介导的细胞信号通路的致病作用,为开发靶向CDCP1的抑制剂和CRPC创新疗法有指导意义。组蛋白赖氨酸乙酰化修饰是表观遗传基因调控的一种重要机制:这是在组蛋白乙酰基转移酶的作用下,在组蛋白赖氨酸残基上添加乙酰基的过程。乙酰化赖氨酸通常由溴域结构域（Bromodomain,BrD）所识别。这种共价化学修饰是一种动态可逆的平衡过程,精确地调控基因的转录和表达,在基因转录激活中发挥重要作用并参与多种细胞生长调控。然而,在癌症中,乙酰化修饰水平异常往往导致癌症基因的表达紊乱,推动肿瘤的形成和发展。值得关注的是,因为表观遗传修饰变化是动态可逆的,利用小分子化学干预能相对容易地治疗表观遗传异常所引发的疾病,因此研究表观遗传学致病的基因转录调控机制,研发小分子药物靶向抑制表观遗传修饰位点,有助于为癌症治疗提供新思路。组蛋白乙酰转移酶同源蛋白p300和CREB结合蛋白（CBP）,以及溴结构域和末端外结构域（BET）家族蛋白（BRD2、BRD3、BRD4和BRDT）是表观遗传调节蛋白和基因转录调控因子。它们的功能依赖于通过溴域结构域（BrD）在染色质上富集,乙酰化组蛋白并/或招募转录相关蛋白参与复合物起始转录。在许多肿瘤中,CBP/p300和BRD4蛋白水平均异常高表达,调控致癌网络（oncogenicnetworks）激活和癌症的致癌过程,与细胞生长、增殖分化、凋亡坏死等多种生物学过程相关,影响多种癌症疾病的发生和发展,因此CBP/p300和BRD4均为重要的药物靶标。因此,开发针对BET或CBP/p300蛋白溴结构域的强效抑制剂,是抑制致癌信号网络的重要一步。研究目的:探究CDCP1基因在CRPC中过度表达的表观遗传调控机制。使用小分子抑制剂靶向CDCP1表达,为PCa提供新的治疗思路。研究方法:表达调控研究:利用WB实验分析PCa细胞中CDCP1以及转录辅助因子BRD4和CBP/p300的表达情况,并利用GEPIA2数据库分析它们之间的相关性。通过敲低或抑制BRD4和CBP/p300蛋白,分析CDCP1基因在转录本和蛋白水平表达的变化,确定BRD4和CBP/p300在CDCP1转录激活中的协同作用机制。通过染色质免疫共沉淀技术确认BRD4和CBP是否同时富集在CDCP1基因的启动子或增强子区域,它们的协同作用可以促进CDCP1基因转录。抑制研究:利用小分子抑制剂JQ1/I-BET762和SGC-CBP30单独或者联合靶向BRD4和CBP/p300蛋白,探究它们对PCa细胞的活力、增殖、周期和迁移的影响,并通过WB实验分析CDCP1相关信号通路信号分子的表达水平变化。同时通过协同作用实验,分析BRD4和CBP/p300抑制剂在PCa细胞中是否具有协同抑制细胞活力作用。选用同时抑制BRD4和CBP/p300溴域（BrD）的双重抑制剂NEO2734验证上述结果。此外,利用蛋白热稳定性和ITC等实验分析NEO2734与BRD4和CBP/p300溴结构域的结合机制。最后,通过X-射线衍射方法探究NEO2734结合BRD4和CBP溴结构域的分子水平作用机制。研究结果:（1）CDCP1蛋白在AR阴性CRPC中过度表达且与BRD4和CBP/p300表达水平呈正相关,是信号传导通路的上游调控因子;（2）CBP/p300 和 BRD4 蛋白共同激活（co-activate）CDCP1基因表达。BRD4和CBP/p300结合到CDCP1基因启动子和增强子位点,并协同促进CDCP1转录激活。联合敲低BRD4和CBP/p300 比单独敲低更加有效地抑制CDCP1的表达;（3）双重靶向CBP/p300和BRD4蛋白对CRPC细胞具有协同抑制功效。联合抑制BRD4和CBP/p300或选用双重抑制剂NEO2734可以比单独抑制更加有效地抑制AR-阳性和AR-阴性CRPC细胞生长;（4）表征NEO2734识别CBP和BRD4溴结构域的蛋白复合分子晶体结构和作用机制。NEO2734与BRD4和CBP/p300的溴结构域均具有较高亲和力,并与它们溴域口袋内的关键保守残基结合;（5）同时靶向 BRD4 和 CBP/p300 可以下调 EGFR、c-Myc、SRC/p-SRC、ERK/p-ERK、Akt/p-Akt等致癌信号通路标志物的水平;揭示了小分子抑制剂对PCa细胞周期、迁移、信号通路的作用机制。研究结论:本研究首次揭示了去势抵抗性前列腺癌中CDCP1的基因转录受到BRD4和CBP/p300所共同激活的重要调控机制,并发现通过双重抑制BRD4和CBP/p300能够直接调控CDCP1所介导的细胞信号通路水平,抑制CRPC细胞增殖的新型分子作用机制,为进一步优化和开发创新型BRD4和CBP/p300双重抑制剂提供了指导方向。