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目的： 通过慢病毒介导CD25siRNA(LV-CD25siRNA)来转染高危角膜移植术后的大鼠角膜，探讨CD25siRNA在角膜移植排斥中的作用。 本实验分为两部分: 实验一:慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白(LV-EGFP)在不同浓度和不同转染途径下对大鼠角膜进行转染的有效性和毒性的研究 实验二:通过慢病毒介导CD25siRNA来干预高危角膜移植术后的大鼠角膜，探讨CD25siRNA在角膜移植排斥中的作用 方法： 实验一:SD大鼠25只，随机分为5组。分别是感染复数(multiplicity of infection，MOI)=5滴眼组(A)、 MOI=5结膜下注射组(B)、MOI=10点眼组(C)、MOI=10结膜下注射组(D)和MOI=10离体转染组(E)。各组角膜按各自条件转染后进行包埋、切片后置于荧光显微镜下观察，并分析荧光强度，然后通过HE染色观察角膜各层组织的变化。 实验二:用NaOH法制备SD大鼠中到重度角膜碱烧伤动物模型，以Lewis大鼠为供体在碱烧伤模型上行穿透性角膜移植来构建高危角膜移植模型，角膜移植术后通过4种不同的方式干预:LV-CD25siRNA滴眼(A)、环孢素A滴眼液(B)、阴性对照病毒（含阴性对照siRNA的慢病毒）(C)、生理盐水(D)。转染后，我们主要通过以下四个方面进行观测。除裂隙灯每天检查外，其余三项检查检查在3、7、14天三个时间点进行检测: 1.裂隙灯下观察各个实验组的角膜术后情况，包括:角膜水肿、浑浊情况，角膜新生血管及前房炎症。 2.HE染色病理切片下角膜组织的变化。 3.运用RT-qPCR检测术后3个时间点角膜中CD25和VEGF-A的mRNA表达情况。 4.运用Western blot检测术后3个时间点角膜中CD25和VEGF-A的蛋白质表达情况。 结果： 实验一:荧光显微镜观察结果显示，同MOI组比较，点眼方式较结膜下注射角膜的荧光分布更加均匀。各组相对荧光强度值分别为:A组0.1803±0.0440，B组0.1061±0.0434，C组0.2369±0.0157，D组0.2002±0.0307，E组0.2434±0.0173，表明点眼方式较结膜下注射角膜的荧光表达更加强烈(P＜0.05)，MOI增加时EGFP表达增强(P＜0.05)。E组与C组表达出最强的的荧光强度，相对比之下两组间不具有统计学差异(P＞0.05)。各组角膜细胞形态正常，未见明显凋亡细胞。离体转染角膜经过7d培养液转染后，角膜内皮细胞仍然生长良好，未见内皮细胞出现皱缩、变形及缺失等病理改变。 实验二:裂隙灯检查结果:术后10天观察到A组角膜植片中央轻度水肿、混浊，未见明确新生血管长入植片，C组和D组可见角膜完全混浊，明显水肿，大量新生血管成簇弯曲长入角膜植片，B组角膜轻度水肿、混浊，6点到9点位可见大量新生血管长入植片。 HE染色检查结果:手术后14天各组角膜HE染色可见，角膜植片均有水肿，植片增厚明显，以角膜基质层增厚为主，A组（CD25组）可见角膜上皮层细胞排列规则、紧密，无明显水肿，角膜基质基质中炎性细胞浸润和新生血管较少，角膜内皮层细胞整齐，形态无明显改变，无明显缺失。B、C、D组发现角膜上皮层部分细胞脱失、排列相对疏松，基质中观察到大量炎症细胞浸润和新生血管管腔形成，内皮细胞结构基本完整。 RT-qPCR结果:A组CD25的mRNA表达在各个时间点均比其余三组有统计学差异，VEGF的mRNA表达与CsA组比较发现差异无统计学意义(P＞0.05)。 Western blot结果:A组(0.362±0.09)与C组(0.994±0.19)及D组(1.07±0.15)两对照组相比VEGF-A蛋白表达减少。B组(0.384±0.13)与A组对比，VEGF-A蛋白表达不具有统计学上的差异。 结论： 1.LV-EGFP能在较低MOI下有效转染大鼠角膜，点眼转染比结膜下注射转染效率更高，提高MOI能提高角膜转染效率，大鼠角膜在较低MOI的持续转染下有良好的安全性。 2.CD25siRNA能有效干扰角膜移植术后角膜植片中CD25的合成，延迟了角膜移植免疫排斥反应的发生，并且还一定程度上抑制了角膜新生血管的发生、发展，我们发现这种抑制可能不是通过VEGF-A的控制来实现，而可能是多种细胞因子间的相互联系来完成的。