前言瞬时感受器电位香草酸亚型1 (transient receptor potential vanilloid subfamily member 1, TRPV1)是近年来发现的存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类与多种感受功能有关的非选择性阳离子通道蛋白,该通道可被多种理化因素激活,主要有辣椒素、大于43℃的热刺激和质子等,且被激活时主要引起Ca2+的大量内流,以胞内Ca2+浓度增高的形式调节着相应的生理功能或病理机制的发生。本研究室以往的研究结果显示,下丘脑中的TRPV1参与了发热过程中的体温调节,特别是对限制体温升高的幅度具有重要的作用。精氨酸加压素(arginine vasopressin, AVP)是一种内源性解热物质,在参与体温调节时脑内最敏感的作用部位是腹中隔区(ventral septal area, VSA),向VSA注射AVP能明显地抑制家兔的发热反应。TRPV1通道阻断剂辣椒平(capsazepine)被广泛应用于对该通道的研究中,capsazepine可有效的抑制TRPV1的活化效应。本实验通过用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)复制大鼠发热模型,结合应用capsazepine抑制TRPV1的活化,观察发热不同时相下丘脑组织中TRPV1表达量、细胞内钙离子浓度变化与AVP含量变化的时相关系,以期进一步探讨机体体温调节过程中限热的生物学机制。材料与方法一、实验动物及处理选用健康雄性SD大鼠120只,体重250-280g,基础体温(38.1±0.2)℃,由中国医科大学实验动物中心提供。饲育室室温(20±2)℃,相对湿度40%-60%,昼夜光照节律12h：12h,单笼饲养,自由进食水。实验中各项操作按常规无菌操作规则进行。将动物随机分为4组：正常对照组(N)：侧脑室注射溶剂10μl,30min后腹腔注射生理盐水4ml·kg-1; (2)Capsazepine组(C)：侧脑室注射Capsazepine 0.02 mg·kg-1配制成10μl(溶剂：10%无水乙醇+10%Tween80+80%生理盐水配制)(Sigma, USA),30min后腹腔注射生理盐水4ml-kg-1; (3)LPS发热组(L)：向侧脑室注射溶剂10μl,30min后腹腔注射LPS4ml·kg-1(20μg·ml-1,用生理盐水配制)(Sigma, USA);(4) Capsazepine+LPS组(C+L)：向侧脑室注射Capsazepine 0.02 mg·kg-1配制成10μl,30min后腹腔注射LPS4ml·kg-1。侧脑室插管采用10%水合氯醛3ml-kg-1腹腔麻醉下,参照大鼠脑图谱(A StereotaxicAtlas of the Rat Brain)进行。各组取6只动物持续观察体温变化540 min,并描绘其体温变化曲线。在各实验条件下取6只动物检测脑内AVP含量、下丘脑[Ca2+]i及TRPV1表达。测试样品的采集及处理如下：N组和C组于注射生理盐水后240min时立即断头采样,L组和C+L组分别在给予LPS后0、120、240、300、360、420和540min时采样。打开颅骨顶,暴露脑组织,按大鼠脑图谱以灰结节和视交叉的中心点为界定部位,取出下丘脑组织,一部分立即进行细胞内钙离子浓度测定,一部分立即投入液氮中速冻固定,20 min后放入-70℃冰箱内待测。测量体温时将数字温度计探头插入大鼠直肠内6cm处,数值稳定后读数,以给药前1h测得的3次直肠温的平均值为大鼠基础体温。实验过程中每30min测温一次。二、脑内AVP含量的测定大鼠处死后,迅速取出下丘脑、腹中隔组织各30 mg,煮沸5 min,加入1 mol·L-1盐酸1 ml充分匀浆后,室温中放置100 min,加入1 mol·L-1氢氧化钠1 ml以中和盐酸,离心3000r·min-1,10min,取上清液按照AVP放免检测试剂盒说明书进行测定。三、下丘脑细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)测定分离出下丘脑组织,制备成单细胞悬液,保持细胞存活率须在95%以上。然后Fura-2/AM避光孵育负载,调激发波长340nm,发射波长510nm,采用日立F-4500型荧光双波长分光光度计测定。四、Western blot检测下丘脑组织TRPV1表达取大鼠下丘脑组织,冰浴匀浆,4℃离心(12000 r·min-1,30min)两次,取上清。进行蛋白定量后,电泳、转膜、封闭,加兔抗大鼠TRPV1单克隆抗体(1：1000),二抗为羊抗兔IgG, ECL化学发光法显色,凝胶成像图像分析系统分析。对照选用抗β-肌动蛋白抗体(β-actin)。目的蛋白与相应β-actin蛋白的灰度比值作为该目的蛋白的相对表达量。五、免疫荧光检测下丘脑组织TRPV1表达将冰冻切片在4℃条件下用丙酮固定10 min,加入山羊血清封闭液孵育1h,兔抗鼠TRPV1抗体(1：100),4℃过夜。翌日切片经0.01M PBS(pH 7.4)充分漂洗后,暗室内滴加山羊抗兔抗体IgG-FITC(1:100),室温孵育1 h,充分清洗后,荧光显微镜下观察并摄片。六、RT-PCR检测下丘脑组织TRPV1 mRNA表达按照Trizol说明书的方法提取下丘脑组织内总RNA,按RT-PCR试剂盒检测方法进行目的基因和内参基因的扩增。反应条件：94℃变性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1min,共35个循环,最后72℃延伸10min。TRPV1上游引物为5’-TTCTGCTCAACATGCTCATTG-3’,下游引物为5’-AATCCTTGAAAACCT CAGC-3’,扩增片段的长度为478bp。PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像分析系统进行基因表达水平分析。七、数据分析所有实验数据均用均数±标准差(x±s)表示,各组均数间差异的比较应用t检验,相关分析用相关性检验分析法。实验结果一、注射LPS后大鼠的体温变化大鼠腹腔注射LPS后,体温明显升高,240min达到高峰(△T：1.20℃±0.21℃),发热大约持续540 min左右体温回降至接近基础水平；在发热期间L组各观察时间点与N组比较体温变化均有显著性差异(P<0.05)。二、capsazepine对体温的影响当预先经侧脑室注入capsazepine,30min后腹腔注射LPS时,即在C+L组体温变化也出现明显升高,大鼠在300min左右体温达到高峰,与N组和C组各采样时间点比较体温变化值有显著性差异(P<0.01)；与L组相比,发热幅度升高,在300-540min期间,两组△T差异均非常显著(P<0.01)；表现为发热时程延长,经540min后体温仍维持在较高水平。三、下丘脑及腹中隔区AVP含量的变化L组VSA中AVP的含量在注射LPS后开始升高,240min时达到高峰(29.81±2.74),与N组比较增加了4.6倍,540min时回降至基础水平,在120、240、300、360min和420 min时间点AVP含量与N组比较差异显著。C+L组VSA中AVP含量的变化趋势与L组相似,300min时达到高峰,在120、240和300 min时间点,则明显低于L组(P<0.05)。L组和C+L组各自0时间点与N组和C组比较均无显著差异(P>0.05)。下丘脑中AVP含量在各组间均无显著性差异(P>0.05)。四、下丘脑神经元[Ca2+]i的变化N组下丘脑细胞内钙离子浓度为144.52±14.04,C组为139.67±14.13,L组(0min)为141.33±15.38,C+L(Omin)为137.17±13.11,以上各组之间没有显著性差异。L组下丘脑细胞内钙离子浓度值([Ca2+]i)在给予LPS后开始升高,240min达到高峰(232±20.34),与L组(0min)比较增加了1.6倍,540min时回降至基础水平,在120、240、300、360和420 min时间点[Ca2+]i与L组(0min)比较差异显著(P<0.05)。C+L组下丘脑细胞内Ca2+浓度在300min达到高峰(197.16±19.64),与C+L(Omin)比较增加了1.37倍。C+L组与L组相比在120、240和300 min时间点显著降低(P<0.05)。五、下丘脑组织TRPV1表达的变化在L组和C+L组TRPV1表达量均随温度升高而增多,在体温处于高峰值时(240、300min) TRPV1表达水平达高峰值,之后,随TRPV1表达量逐渐降低,体温逐渐下降。在L组体温处于高峰时,TRPV1表达量为基础状态的2.18倍。C+L组TRPV1表达量在120min、240min、300min、360 min组均低于对应的L组(P<0.05)。结论1、应用TRPV1特异性阻断剂capsazepine对正常体温水平没有明显的影响。2、在LPS致热过程中,体温升高到一定程度可诱导下丘脑中TRPV1的表达和开放,TRPV1通过下丘脑细胞内Ca2+浓度升高,导致作用于腹中膈区的AVP含量增多,这可能是其发挥限热作用的途径之一。