自噬（autophagy）是一些受损的蛋白质或细胞器被双层膜结构的自噬体包裹后,送入溶酶体（动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用的过程。丝氨酸/苏氨酸激酶CK1家族通过结合和磷酸化不同的蛋白质底物来调节多种细胞过程,包括膜转运、DNA修复、凋亡和自噬等。研究发现CK1家族中的酪蛋白激酶1α1（CK1α）作为自噬诱导剂,通过激活调节自噬、抑制肿瘤的PTEN/AKT/FOXO3a/ATG7轴,进而抑制肿瘤生长。在酿酒酵母中CK1家族成员Hrr25能够通过磷酸化COPII囊泡上的Sec24参与巨自噬的调控,并在选择性自噬中磷酸化自噬货物受体蛋白。但是CK1家族中的酪蛋白激酶1δ（CK1δ）与自噬的关系未明确,为了解决这一问题,我们着重研究CK1δ在哺乳动物细胞巨自噬中的作用,及其作用机制。为了阐明CK1δ是否参与巨自噬,我们首先利用si RNA干扰技术对CK1δ进行敲低,在敲低CK1δ的He La细胞系中用Western Blot和免疫荧光检测自噬底物p62和自噬标志物LC3-II的水平,实验结果表明,敲低CK1δ,饥饿条件下与对照细胞相比,自噬底物p62积累,自噬相关蛋白LC3-II增加,说明饥饿诱导的巨自噬通路受阻,并且不影响LC3-II脂化。在饥饿条件下加入bafilomycin A1（抑制自噬体与溶酶体融合）时,p62、LC3-II均明显积累,说明敲低CK1δ,自噬通路受阻在自噬体与溶酶体融合之前。这些数据提示我们在敲低CK1δ的细胞系中自噬通路受阻在LC3-II脂化之后和自噬体与溶酶体融合之前。然后我们进一步解析CK1δ在饥饿诱导的巨自噬通路中的具体作用位点。利用RFP-GFP-LC3串联荧光报告质粒检测自噬体和自噬溶酶体的数目,发现在敲低CK1δ的细胞系中,自噬体的数量明显增加,而自噬溶酶体的数量减少,结果说明自噬缺陷发生在自噬体与溶酶体融合之前,导致自噬体大量积累。随后使用蛋白酶K保护实验,鉴定自噬缺陷发生在自噬体闭合之前或之后,在CK1δ敲低细胞系中只加蛋白酶K条件下p62和GFP-LC3均不受保护,说明p62和GFP-LC3对蛋白酶K的敏感性增加,不受自噬体保护,自噬缺陷发生在自噬体闭合之前。这些数据表明CK1δ调控自噬体闭合。接着通过免疫荧光检测敲低CK1δ细胞系对自噬通路上ATG复合物的影响,发现在敲低CK1δ的细胞系中饥饿诱导的ATG16L1,ATG14L,ATG9A点状结构数目均没有明显变化,且ATG16L1,ATG14L,ATG9A与LC3的共定位增加,提示敲低CK1δ影响ATG蛋白从自噬体膜上解离,导致ATG16L1,ATG14L,ATG9A与LC3一起被困在自噬隔离膜上。这些数据与CK1δ调控自噬体闭合阶段结论一致。为了解析CK1δ调控自噬体闭合的分子机制,本课题利用免疫共沉淀实验从已知参与自噬体闭合的因子中筛选CK1δ互作蛋白,发现参与膜融合的SNARE蛋白Syntaxin13（STX13）与CK1δ互作。综上所述,本课题首先明确CK1δ参与饥饿诱导的巨自噬,并证明CK1δ调控自噬体闭合。最后我们初步筛选出参与自噬体闭合的CK1δ互作蛋白STX13。本课题首次揭示哺乳动物细胞中CK1δ在饥饿诱导的巨自噬过程中的重要作用及具体调控阶段,不仅为深入理解CK1δ调控自噬的分子机制提供了新思路,而且有助于深化对自噬体形成过程的认识。