【摘 要】
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郫县豆瓣酱是我国著名的发酵调味品,在中餐中广泛食用。营养性和功能性是豆瓣酱重要的健康指标。生物活性肽对营养和功能都起着重要作用,例如日本和韩国等意识到它的重要性,并已经进行了广泛和深入研究。目前国内已有研究发现郫县豆瓣酱具有血管紧张素转换酶(angiotensin-I-converting enzyme,ACE)抑制活性和抗氧化活性,但有关生物活性物肽的研究很少。因此本课题为探究和增加豆瓣酱的营养
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郫县豆瓣酱是我国著名的发酵调味品,在中餐中广泛食用。营养性和功能性是豆瓣酱重要的健康指标。生物活性肽对营养和功能都起着重要作用,例如日本和韩国等意识到它的重要性,并已经进行了广泛和深入研究。目前国内已有研究发现郫县豆瓣酱具有血管紧张素转换酶(angiotensin-I-converting enzyme,ACE)抑制活性和抗氧化活性,但有关生物活性物肽的研究很少。因此本课题为探究和增加豆瓣酱的营养性和功能性,以郫县豆瓣酱为原料,以ACE抑制和抗氧化活性为指标,通过水提(酶解)、超滤、反相半制备分离活性肽组分,采用高分辨液质对游离和酶解多肽进行鉴定,采用体外活性测定、Peptide Ranker和Autodock Vina分子对接技术快速筛选高活性肽段,通过三重四极杆质谱对目标活性肽进行定量,并基于分子对接技术研究了相关活性机理。以期为郫县豆瓣酱营养性、功能性、精深加工和高值化提供科学依据。主要研究内容及结果如下:(1)游离多肽组分的提取、分离和鉴定。以ACE抑制和抗氧化活性为导向,应用超滤、反相半制备分离游离多肽组分,在高活性组分Ⅲ和组分Ⅳ中鉴定到4条新的未报道的ACE抑制肽和抗氧化肽,分别为RGLSK、NKGPR、DNLLN和TPCPPQ,分子量为560.3661~642.3400。经体外活性测定,肽RGLSK的ACE抑制活性最高,半抑制浓度IC50为87.35μmol·L-1;肽TPCPPQ的抗氧化活性最高,ABTS·+总抗氧化活性为535.17μmol TEAC·g-1,DPPH·自由基清除活性为62.62%。(2)游离多肽含量的测定。应用UPLC-QQQ-MS优化肽段定量离子、碰撞电压、锥孔电压等质谱参数并定量。结果表明游离多肽的含量为80.21~839.64μg·g-1 DW,其中NKGRP的含量最高为839.64μg·g-1 DW。(3)采用Autodock Vina分析ACE抑制活性最高的肽RGLSK和抗氧化活性最高的肽TPCPPQ的活性机理。RGLSK与ACE酶的Ala354、Tyr523、Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520氨基酸之间通过13个氢键相互作用,键长为1.9(?)~2.7(?)。TPCPPQ与Kelch样ECH-相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)的Ser602、Arg380、Asn414、Gln530和Arg553氨基酸之间通过7个氢键相互作用,键长为2.0(?)~2.6(?)。(4)郫县豆瓣酱蛋白酶解液低分子量肽段的分离与鉴定。采用碱溶酸沉法提取豆瓣酱总蛋白,以蛋白水解度和生物活性为筛选指标,选择碱性蛋白酶酶解。基于活性导向原则,通过超滤和反相半制备分离得到高活性组分E~H,首次平行采用传统方法鉴定蛋白酶解短肽(3~5个氨基酸);Uniport蛋白质数据库和从头测序结合的肽组学方法鉴定蛋白酶解中长肽(6~10个氨基酸)。共鉴定到19条新的短肽和5848条中长肽,其中短肽包括5条三肽、8条四肽、6条五肽;中长肽包括1484条六肽、1217条七肽、1634条八肽、927条九肽和586条十肽。(5)短肽活性机理和高生物活性中长肽的筛选以及目标肽段的定量。经体外活性测定,19条短肽均有ACE抑制和抗氧化活性,其中LASPK的ACE抑制活性最高(IC50为48.12μmol·L-1),SVLY有最强的抗氧化活性(ABTS·+,3227.18μmol TEAC·g-1,DPPH·,18.39%)。通过Autodock Vina分子对接发现短肽LASPK、SGF和VFPH的结合能分别为-7.9~-8.8 kcal·mol-1,SVLY与Keap1蛋白共形成7个氢键作用力。经Peptide Ranker和分子对接发现前15条中长肽均能与ACE酶和Keap1蛋白稳定存在并形成氢键作用力,结合能分别为-8.6~-11.6 kcal·mol-1和-6.0~-9.1 kcal·mol-1,筛选肽段的体外生物活性验证了Peptide Ranker和分子对接技术筛选高活性肽段的快速性和有效性。基于UPLC-QQQ-MS技术,酶解后目标肽段的含量为9.67~3026.80μg·g-1 PBBP DW,LASPK的含量最高为3026.80μg·g-1 PBBP DW。
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