肝癌是恶性程度极高,预后极差的恶性肿瘤。全世界半数左右的肝癌患者集中在中国,我国每年约有30万人死于肝癌,居恶性肿瘤病死率的第二位。虽然目前对肝癌发生的危险因素了解较多,但对肝癌发生的分子细胞学机制尚不明确。因此,对肝癌发病分子机制的研究尤为重要和迫切。由Cullin家族成员作为骨架蛋白参与构成的CULLIN-RING连接酶复合物(CRLs)是目前已知最大的E3泛素连接酶家族,其在泛素-蛋白酶体降解过程和蛋白泛素化修饰中发挥了不可或缺的作用。目前已知,人类基因组编码CUL1、 CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7及PARC等8个Cullin家族成员,该家族成员通过参与蛋白质泛素化修饰而调控众多生命活动过程,包括生长发育、肿瘤发生、细胞周期、信号转导、病毒感染及转录调控等。在Cullin家族成员中,CUL4A与CUL4B的同源性最高,结构最为相似,两者都以DDBl做为衔接蛋白。目前发现CUL4A在乳腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞瘤、间皮瘤等多种肿瘤中表达上调,但CUL4B在肿瘤发生发展中的作用近年来才得到关注。我们的前期研究结果显示CUL4B在食管癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌及宫颈癌等肿瘤中表达上调,对其机制研究发现,CUL4B通过协同PRC2复合物抑制一组抑癌基因表达,进而影响肿瘤的发生发展。但CUL4B在肝癌中的表达情况及其作用机制目前尚不清楚。为此,本研究通过肝细胞癌细胞系、肝癌组织标本及CUL4B转基因小鼠多种模型研究CUL4B在肝细胞癌发生发展中的作用及分子机制。第一部分CUL4B抑制Wnt通路拮抗分子表达,促进p-Catenin依赖的肝细胞癌发生一方面CUL4B在多种肿瘤中高表达,另一方面,Wnt/β-Catenin通路在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中异常激活,提示CUL4B和Wnt/β-Catenin通路可能存在正相关性,但目前研究却提示β-Catenin是CRL4B的底物。为明确CUL4B和β-Catenin在肝细胞癌发生中作用及其两者之间的关系,本部分以肝细胞癌细胞系和肝癌组织标本为研究对象,进行了系统分析,取得了如下结果：1) CUL4B在肝细胞癌细胞系和肝癌组织中表达上调：采用Western bloting方法检测了CUL4B在永生化正常肝脏细胞HL-7702、L02和肝癌细胞株Huh-7、 HepG2、BEL-7402及SMMC-7721中的表达情况,发现CUL4B在这些细胞中均有较高含量,但与正常细胞株相比,(CUL4B在肝癌细胞株中的表达水平较高。通过、Western blotting对实验室前期收集的24对肝细胞癌临床样本中CUL4B表达进行检测,结果显示CUL4B在62.5%(15/24)病例的肿瘤组织中表达水平明显高于癌旁组织。进一步对161对肝细胞癌标本进行CUL4B免疫组化检测,结果显示51.5%(83/161)肝细胞癌病例的肿瘤组织中CUL4B表达上调。2)β-Catenin在肝细胞癌中表达上调,且与CUL4B表达水平呈正相关:Western blotting对实验室前期收集的肝细胞癌临床样本中β-Catenin含量进行检测,结果显示β-Catenin在45.8%(11/24)肝癌病例的肿瘤组织中表达水平高于癌旁组织。进一步对110例肝细胞癌患者癌组织及其癌旁组织标本进行β-Catenin免疫组化检测,结果显示46.4%(51/110)肝癌病例的肿瘤组织中β-Catenin表达上调。与CUL4B表达水平检测结果联合分析,结果显示CUL4B表达水平与β-Catenin表达水平正相关。3) CUL4B正向调控Wnt/β-Catenin通路：为进一步明确CUL4B与Wnt/β-Catenin通路的关系,我们在肝癌细胞系中干扰或过表达CUL4B并对Wnt/β-Catenin通路进行分析。发现干扰CUL4B表达明显减少细胞中β-Catenin水平和活性,过表达CUL4B显著增加细胞中β-Catenin水平和活性。实时定量PCR检测发现,干扰或是过表达CUL4B并未影响β-Catenin的mRNA含量,这提示CUL4B影响β-Catenin的表达水平是发生在转录后水平。加入MG132可以缓解由于低表达CUL4B所引起的P-Catenin下调的现象,对Wnt/β-Catenin通路靶基因Cyclin D1的表达情况分析同样证实了这一结果,这提示CUL4B可能在翻译后水平对β-Catenin进行调控。半衰期实验也证实低表达CUL4B可以加快β-Catenin降解。以上结果说明CUL4B调控β-Catenin发生在蛋白降解水平。4) CUL4B通过下调GSK3活性抑制β-Catenin降解：文献报导β-Catenin降解通常发生在其被磷酸化修饰后,而可磷酸化β-Catenin的激酶包括CK1及GSK3β。检测干扰CUL4B表达后GSK3β的含量,结果显示干扰CUL4B表达并不影响GSK3β的总量及失活形式,但可以通过下调GSK3β的活性形式而影响P-Catenin的降解。为证实以上结果,我们采用三种GSK3抑制剂(LiCl、CHIR99021及SB216763)处理细胞,结果发现三种抑制剂处理均可以部分拯救由于低表达CUL4B所引起的P-Catenin下调,对其靶基因Cyclin D1表达水平的分析也证实抑制GSK3活性可以缓解低表达CUL4B所引起的P-Catenin下调的现象。5) CUL4B通过抑制Wnt通路拮抗分子表达进而激活Wnt/β-Catenin通路：为进一步探究CUL4B调控GSK3β的机制,我们在CUL4B低表达及对照细胞系中检测了10种功能明确的Wnt/β-Catenin通路拮抗分子的表达情况,结果显示CUL4B可以通过下调Wnt/β-Catenin通路拮抗分子PPP2R2B、DKK1、AXIN2及PPP2CB的表达而激活Wnt/β-Catenin通路。在低表达CUL4B的同时干扰PPP2R2B可以部分缓解由于CUL4B下调所引起的总的及活性形式β-Catenin的表达下调,对靶基因Cyclin D1的分析也支持这一结论。对β-Catenin蛋白降解过程分析结果显示,在低表达CUL4B的同时干扰PPP2R2B可以缓解由于CUL4B下调所引起的β-Catenin降解过程。6) CRL4B协同PRC2共同调控Wnt/β-Catenin通路拮抗分子的表达：为分析CUL4B调控Wnt/β-Catenin通路拮抗分子的作用机制,我们利用ChIP实验检测CUL4B和PRC2复合物关键组分EZH2在PPP2R2B、DKK1及PPP2CB基因启动子区域结合情况,结果显示CUL4B和EZH2共同结合于PPP2R2B、DKK1及PPP2CB基因启动子区域,同时其催化产物H3K27me3及H2AK119ub1也在这些区域明显富集。q-ChIP结果显示在低表达CUL4B的SMMC-7721细胞中CUL4B、EZH2、H3K27me3及H2AK119ub1在PPP2R2B及DKK1的启动子区域均明显减少。7)CUL4B通过上调Wnt/β-Catenin通路活性促进肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及体内肿瘤生长过程：MTT、克隆形成及Transwell实验结果显示CUL4B可以促进肝癌细胞增殖,增加克隆形成数目,上调其细胞迁移能力,在低表达CUL4B的同时干扰PPP2R2B可以拯救由于低表达CUL4B所引起的表型效应。随后利用裸鼠皮下成瘤实验证实CUL4B在体内可以促进肝癌细胞的成瘤能力,对肿瘤内CUL4B、PPP2R2B、β-Catenin及其靶基因c-Jun的免疫组化分析结果显示,CUL4B的表达水平与PPP2R2B表达量呈负相关、而与β-Catenin及其靶基因c-Jun表达水平呈正相关。这提示CUL4B促进肝癌细胞增殖及迁移至少部分是通过调控Wnt/β-Catenin通路P-Catenin及其靶基因c-Jun实现的。综上所述,在肝癌细胞中CRL4B协同PRC2复合物共同抑制多种Wnt/β-Catenin通路拮抗分子的表达从而影响GSK3活性,阻断P-Catenin的降解过程,使其在细胞浆中累积,入核后促进下游靶基因(c-JUN及CCND1)的表达,进而促进肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和肿瘤生长等过程。第二部分利用CUL4B转基因小鼠研究CUL4B在肝细胞癌发生过程中的作用及其机制在小鼠体内建立肝癌模型对于研究肝癌的发生发展规律、寻找有效干预及治疗方法具有重要意义。为探究CUL4B在肝细胞癌发生发展中的作用和机制,本部分我们建立了CUL4B转基因小鼠,进一步分析CUL4B在小鼠肝脏自发成瘤模型和DEN诱导肝癌模型中的作用,取得了如下结果：1)建立并鉴定CUL4B转基因小鼠模型：将实验室前期构建的人类CUL4B基因全长表达载体线性化处理,采用显微注射的方法注入受精卵的原核中,将其植入受体小鼠的输卵管内,共获得3个品系,并利用RT-PCR对各品系转基因效率进行了检测,最终选取2个品系用于进一步实验。采用Western blotting方法对外源性CUL4B的表达情况进行检测,结果显示不论是在CUL4B转基因小鼠的胚胎成纤维细胞,还是肝脏组织中外源性转入的CUL4B基因均可以高效表达。Real-time RT-PCR检测CUL4B在转基因小鼠各组织的表达情况,结果显示在肝脏、心脏、血液、胸腺、脾脏、肺脏及结肠等多种组织中过表达效率较好,均有统计学意义。2)CUL4B转基因小鼠肝脏增殖能力明显增强：对出生后14d小鼠肝脏组织进行BrdU掺入实验检测肝脏细胞的增殖情况,结果显示CUL4B转基因小鼠肝脏细胞增殖能力明显高于野生对照小鼠。为分析其机制,我们提取肝脏蛋白检测与细胞周期相关分子的表达情况,结果显示Cyclin D1、Cdk1和Cdk4的表达水平在转基因小鼠肝脏中明显升高,而p16的表达明显下调。对小鼠肝脏内凋亡进行检测,并未发现两组小鼠存在明显差异,H&E染色结果也提示CUL4B转基因小鼠和野生对照小鼠肝脏结构无明显差异。3)CUL4B转基因小鼠自发肝癌：为明确CUL4B基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用,我们将雄性CUL4B转基因小鼠和同窝雄性野生型对照小鼠饲养至2年,解剖观察其是否自发肿瘤,结果显示,CUL4B转基因小鼠肝脏上存在肉眼可见的白色结节,发生率为80%(4/5),对其肝脏进行组织切片及H&E染色,结果显示结节内细胞紧密,为典型的肿瘤结构。说明CUL4B转基因小鼠可自发肝癌。4)过表达CUL4B促进DEN诱导小鼠肝细胞癌的发生发展：为进一步明确过表达CUL4B在肝细胞癌发生发展中的作用,我们分析了过表达CUL4B对DEN诱导小鼠肝细胞癌的影响。分别选取雄性和雌性CUL4B转基因小鼠及其同窝野生型对照小鼠,建立DEN诱发肝癌模型,分别在26周及52周处死小鼠,观察两组小鼠的成瘤情况,结果显示CUL4B转基因小鼠在肿瘤的数目、肿瘤的最大径、肝脏系数(肝脏重量/体重)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)及谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)等各个指标方面均明显高于野生型对照小鼠。5)过表达CUL4B促进DEN诱导的急性肝损伤：为进一步探讨CUL4B促进DEN诱导小鼠肝细胞癌发生发展的原因,我们通过对CUL4B转基因小鼠及对照小鼠注射DEN,诱导急性肝损伤,分析过表达CUL4B对DEN诱导的急性肝损伤的影响。结果显示CUL4B促进DEN诱导后小鼠肝脏的代偿性增殖及相关信号通路的激活,并伴随肝脏内ROS水平的上调。进一步实验证实CUL4B可以通过下调Prdx3表达进而影响肝脏内ROS清除能力,导致ROS增高进而促进肝细胞癌发生发展。综上所述,我们成功构建了CUL4B转基因小鼠,发现过表达CUL4B可以促进肝脏细胞的增殖；CUL4B转基因小鼠在2年左右可以自发肝癌；通过在建立DEN诱发肝癌模型也证实CUL4B能够促进肝细胞癌发生和转移。对CUL4B促进肝细胞癌发生的机制分析发现CUL4B通过调控肝脏内Prdx3水平进而影响ROS水平,从而促进肝癌发生。