Cellulomonas carboniz T26淀粉蔗糖酶的性质鉴定与应用

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淀粉蔗糖酶(amylosucrase)是属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)13家族的葡糖基转移酶(glucosyltransferase,EC 2.4.1.4)。可以以蔗糖为唯一底物,通过生物催化,将蔗糖转化为一种以α-(1,4)糖苷键连接的葡聚糖。淀粉蔗糖酶可以进行水解反应、转糖苷反应和聚合反应,因此淀粉蔗糖酶在碳水化合物转化领域应用广泛。转糖苷反应是淀粉蔗糖酶非常优异的性质,可以将供体葡萄糖基转移到受体单元上(如水杨苷、儿茶素、对苯二酚等),使受体获得稳定性、水溶性等优异的特性。首先,本课题利用基因工程手段获取革兰氏阳性菌Cellulomonas carboniz T26中淀粉蔗糖酶的基因片段,将其连接到pET-22b(+)载体上,构建重组pET-CC-AS质粒。接着,将构建的重组质粒转化至感受态细胞中,经过扩大培养、IPTG蛋白诱导、镍离子亲和层析柱纯化、透析获得重组酶CC-AS。使用SDS-PAGE蛋白电泳,发现IPTG诱导过程中目的蛋白浓度不断提高且纯化后可于70 kDa处发现单条带,与理论分子质量一致。其次,以蔗糖为唯一底物,在合适的反应条件下反应,发现淀粉蔗糖酶可将蔗糖聚合为葡聚糖。对CC-AS的酶学性质研究,发现重组酶的转糖苷酶活显著高于水解酶活(转糖苷水解酶活比(T/H)范围为18),这赋予CC-AS非常好的应用前景;该酶的最适pH、最适温度(总酶活、转糖苷酶活)分别为pH 7.0和40°C与水解酶活不同;该重组酶对热较为敏感,在45°C和50°C下的半衰期分别为3.3 h和7.2 min,但在最适温度下(40°C,半衰期t1/2=277 h)有很好的热稳定性,说明该酶工业应用潜力大;此外,本研究中所有的二价金属离子均抑制了酶的活性,其中Cu2+彻底抑制了酶活。再次,对淀粉蔗糖酶的产物结构进行研究,通过碘显色法、红外光谱法、核磁共振法(1H-NMR,13C-NMR和HSQC二维谱)三种方法相互印证,证明当以蔗糖为唯一底物时,在标准反应条件下,可以生成纯净的以α-(1,4)糖苷键连接的葡聚糖(α-(1,4)-glucan)。使用离子交换色谱法,一方面,通过计算发现CC-AS水解反应:聚合反应:异构反应=5.8:84.0:10.2,其聚合反应相比于文献报道有一定优势;另一方面,温度影响了聚合,实验结果证明低温可以有助于CC-AS延伸聚糖。最后,以蔗糖和对苯二酚分别作为葡糖基供体和受体,使用重组酶CC-AS通过转糖苷反应合成价格昂贵、功能多样的α-熊果苷。发现产α-熊果苷反应在其最适pH 7.0和最适温度40°C下的摩尔产率可达到40%44.7%;探究L-抗坏血酸对反应的影响,发现L-抗坏血酸对CC-AS催化的、低对苯二酚浓度的反应影响不大,提供了低浓度转化思想;探究供受体比例以及浓度对反应的影响,发现供受体最适比例为4:1,且由于CC-AS优异的转糖苷活性,在高浓度下也有相对于文献非常突出的表现;最终提出在酶浓度70μg/m L(1.26 U/m L),供受体比例D/A=4:1,反应温度40°C,pH 7.0下反应2 h可以获得理想的α-熊果苷产率。
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