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研究目的:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是动脉病理改变性疾病中最常见的一种,是冠心病的重要病理生理基础。动脉粥样硬化是由多因素长期共同作用导致的恶性循环性疾病,尽管经过多年的研究探索形成了多种学说,但至今尚未完全阐明动脉粥样硬化的机制。人类基因组计划研究发现,哺乳动物基因中超过98%转录为非编码RNA,只有不到2%的基因转录为蛋白质。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类转录物长度大于200 nt且不具有蛋白编码功能的调节性非编码RNA。lncRNA牛磺酸上调基因1（taurine up-regulated gene 1,TUG1）位于chr22q12.2,长7.1 kb,在牛磺酸处理的小鼠视网膜细胞中首次检测到。最近的研究发现,lncRNA TUG1可参与心血管疾病的进展,然而,lncRNA TUG1调节动脉粥样硬化进展的分子机制却不甚清楚,尤其是否可以通过调控自噬及炎症反应发挥抗动脉粥样硬化的作用尚未见相关报道。为更深入地了解动脉粥样硬化的发病机制,本文选择冠心病患者外周血、人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）及动脉粥样硬化大鼠为模型,拟研究lncRNA TUG1在动脉粥样硬化中的作用及分子机制。方法:自噬部分:首先,用荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）检测无冠心病的对照人群与冠脉狭窄>80%的冠心病病人外周血中lncRNA TUG1的表达。用CCK-8、Ed U及划痕实验检测TUG1敲低（si-TUG1）后HUVECs细胞的增殖迁移能力。用m RFP-GFP-LC3、Western blot检测TUG1敲低后自噬小体的表达量及自噬金标准蛋白p62、LC3II的蛋白表达。q RT-PCR检测二甲双胍给药后HUVECs细胞中TUG1的表达。通过转染TUG1过表达质粒,观察其对二甲双胍功能的回复效果;再通过AMPK抑制剂（Compound C）孵育,观察其对si-TUG1的回复效果,分析TUG1发挥生物学功能的分子机制及二甲双胍的治疗作用。Wistar大鼠造动脉粥样硬化模型,造模30天后,40μl/只TUG1(1.1×1013v.g/ml)腺相关病毒或空载病毒经舌下静脉注射相应大鼠。此外,二甲双胍组灌胃给予100 mg/kg/day二甲双胍,阳性对照组灌胃给予2.1?mg/kg/day阿托伐他汀,正常对照组及AS模型组灌胃给予同体积生理盐水,均灌胃30天。处死大鼠,留取主动脉做以下检测:HE染色,计算病变面积;q PCR检测各组中TUG1的表达;免疫组化检测LC3、p62的表达;Western blot检测AMPK/mTOR信号通路蛋白的表达。炎症部分:q RT-PCR检测不同浓度ox-LDL孵育后细胞中TUG1的表达,冠心病病人外周血中miR-140-3p、IL-8的m RNA水平。q RT-PCR及Western blot检测ox-LDL孵育及敲低TUG1表达后细胞中IL-8、MMPs以及miR-140-3p的表达,miR-140-3p敲低及过表达之后IL-8、MMPs的表达水平。荧光素酶报告基因检测TUG1与miR-140-3p的结合,以及miR-140-3p与IL-8的结合作用。为明确TUG1通过miR-140-3p,以及miR-140-3p通过IL-8对炎症反应的作用,进行了回复实验,并采用Western blot和ELISA分别检测各组细胞及上清液中IL-8、MMPs的蛋白表达。另取正常对照组、AS模型组、sh-NC、sh-TUG1四组中的粥样动脉组织做以下检测:免疫组化检测IL-8、MMPs的表达;荧光原位杂交检测miR-140-3p的表达。结果:自噬部分:q RT-PCR结果显示冠心病患者外周血中TUG1的m RNA水平明显升高。用小干扰RNA敲低TUG1的表达后,HUVECs细胞的增殖迁移能力降低,并同时升高细胞的自噬水平。二甲双胍给药后HUVECs细胞中TUG1的表达水平呈时间依赖性降低,并能显著降低细胞的增殖迁移能力而促进细胞的自噬水平。回复实验结果显示:沉默lncRNA TUG1通过AMPK/mTOR信号通路促进HUVECs细胞的自噬并抑制其增殖迁移作用,且二甲双胍可通过TUG1激活AMPK/mTOR信号通路。HE染色结果显示:与对照组相比,AS模型组血管病变面积明显增加,提示造模成功;而二甲双胍与sh-TUG1对高脂饲料诱导的动脉粥样硬化损伤具有保护作用。q RT-PCR结果显示:AS模型组的TUG1表达水平升高;而二甲双胍组、sh-TUG1组TUG1的表达水平降低。免疫组化及Western blot结果显示:与对照组相比,AS模型组存在一定水平的自噬缺陷;与AS模型组或sh-NC组相比,二甲双胍给药及sh-TUG1可通过激活AMPK/mTOR信号通路促进自噬。炎症部分:q RT-PCR及Western blot结果显示:ox-LDL孵育后HUVECs细胞中TUG1的表达水平呈浓度依赖性升高;且IL-8、MMP-2和MMP-9的表达水平均显著升高,而miR-140-3p的表达水平明显下降。TUG1沉默后能降低IL-8、MMP-2和MMP-9的表达,而升高miR-140-3p的表达;敲低miR-140-3p的表达可显著升高IL-8、MMP-2和MMP-9的m RNA水平;此外,冠心病病人外周血中miR-140-3p的表达降低而IL-8的表达升高。荧光素酶报告基因结果提示TUG1与miR-140-3p存在直接结合作用,miR-140-3p与IL-8存在直接结合作用。回复实验结果显示:miR-140-3p抑制剂与si-TUG1共孵育能逆转TUG1敲低引起的蛋白水平降低,且IL-8过表达质粒与miR-140-3p模拟物共孵育能部分逆转miR-140-3p模拟物单独转染引起的蛋白水平改变。免疫组化及荧光原位杂交结果显示:与对照组比较,AS模型组IL-8、MMP-2及MMP-9的表达升高,而miR-140-3p水平降低;与sh-NC组比较,sh-TUG1组IL-8、MMP-2及MMP-9的表达降低,而miR-140-3p表达水平增加。结论:（1）冠心病患者外周血及大鼠动脉粥样硬化斑块中lncRNA TUG1、IL-8的表达水平明显升高,而miR-140-3p的表达水平降低。（2）二甲双胍给药或敲低TUG1的表达均可抑制HUVECs的增殖迁移,并激活自噬,这与二甲双胍通过靶向lncRNA TUG1激活AMPK/mTOR信号通路发挥抗动脉粥样硬化作用有关。（3）沉默TUG1可升高miR-140-3p的表达而降低IL-8的表达,这与沉默TUG1可通过miR-140-3p/IL-8轴抑制炎症反应有关,为动脉粥样硬化的临床治疗提供了新的理论依据及可能的新靶点。