二氯甲烷（DCM）是一种高挥发性化合物,被广泛用作工业溶剂。它在水溶液中稳定,半衰期超过700年,在大气中约为150天。DCM具有严重的遗传毒性,因此需要严格的处理条件才能最大限度地减少其对人体的危害。目前已经开发了多种方法,包括焚烧、吸收、氧化、冷凝和生物降解,用于去除环境中的DCM。其中,生物法因其反应条件温和,成本低,去除率高,无二次污染而日益普及。微生物细胞中的DCM脱卤酶可以催化DCM的降解。然而,由于传质慢和酶活性及含量低,微生物细胞中天然存在的DCM脱卤酶的效用通常受到限制。基于此,本论文期望通过异源表达DCM脱卤酶,优化产酶条件来提高DCM脱卤酶的表达量,并借助生物信息学分析和实验探究DCM脱卤酶的结构并进行改造,得到酶活力更高的DCM脱卤酶。首先将编码DCM脱卤酶的基因从Methylobacterium rhodesianum中克隆并在大肠杆菌中表达。对重组菌的产酶条件进行优化,发现其最适产酶条件是诱导温度20℃,诱导时间8 h,培养基pH为7。构建了分子伴侣共表达菌株,发现伴侣质粒pGro7表达的蛋白使可溶性DCM脱卤酶的表达量提升了近50%。此外,通过包涵体的折叠复性,得到了更多可溶的DCM脱卤酶。使用同源建模和保守结构域分析对DCM脱卤酶的结构进行预测,发现DCM脱卤酶属于谷胱甘肽转移酶（GST）家族,由N末端β折叠结构域和C末端α螺旋结构域组成。底物结合在C末端α螺旋之间的裂隙中。基于以DCM为配体的DCM脱卤酶分子对接分析,将底物结合口袋和10个保守氨基酸残基的所有靶氨基酸残基分别突变为丙氨酸（Ala）。测定活性后,选取R120,L121,W128和T146进行饱和突变。结果显示dcmT146A、dcmT146R和dcmT146Q具有更高的活性,而dcmL121A、dcmT146L、dcmL121Q和dcmL121F的活性基本保持不变。接下来,选择这7个突变体进行双突变。结果发现突变体dcmL121A/T146R表现出最高的酶活力,相对于野生型DCM脱卤酶的活性提高了52.8%。通过分析比较野生酶和突变体dcmL121A/T146R的结构,探究了结构和功能的关系,发现突变体dcmL121A/T146R在活性中心具有更小的空间位阻,底物结合口袋氨基酸残基的数量从8个减少到5个,同时酶分子整体的亲水性增加。此外,底物结合口袋内疏水性氨基酸残基的比例增加并且K_m值变小。据推测,突变体dcmL121A/T146R中所有的这些变化可能有助于DCM脱卤酶催化活性的增加;此外还对比研究了两者的酶学特性,发现突变型和野生型酶具有相似的酶活变化规律。为了提高DCM脱卤酶的使用寿命,进行了酶的固定化研究。使用氧化石墨烯（GO）来固定DCM脱卤酶,提高了DCM脱卤酶的热稳定性。研究还发现,在交联剂戊二醛和金属离子Fe²⁺的作用下,GO的固定化效率大大提高。固定化酶的最适pH向碱性偏移。此外,固定化酶使用6次以后,酶活仍然保留50%。