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L-丝氨酸作为一种氨基酸类药物以及化工领域最具吸引力的三十种骨架化合物之一,拥有广阔的市场与应用前景。微生物利用糖质原料直接发酵生产L-丝氨酸,具有原料来源丰富,生产过程可持续,绿色环保等优点而备受关注。课题组前期对产L-丝氨酸的野生型谷氨酸棒杆菌进行传统诱变和代谢工程改造,获得一株具有工业应用前景的L-丝氨酸高产菌株?SSAAI。但菌株?SSAAI生产效率仍然不高,进一步提高其产量却碰到了瓶颈,探究其原因可能是重组菌大量合成L-丝氨酸后,难以高效转运到胞外,转运途径的强化有利于提高L-丝氨酸的产量。然而,在谷氨酸棒杆菌中关于L-丝氨酸转运蛋白,仅有的报道为L-苏氨酸转运蛋白ThrE同时具备L-丝氨酸的转运能力,因此挖掘和利用谷氨酸棒杆菌中L-丝氨酸的转运蛋白具有重要意义,为代谢工程改造L-丝氨酸生产菌株提供新思路。本论文以高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌?SSAAI作为研究对象,首先考察了文献报道的转运蛋白ThrE对L-丝氨酸的转运作用;继而利用前期基因组测序信息与基因序列比对挖掘新的L-丝氨酸转运蛋白。论文主要研究内容如下:(1)考察谷氨酸棒杆菌?SSAAI中转运蛋白ThrE对L-丝氨酸的转运作用。文献报道ThrE是谷氨酸棒杆菌中L-苏氨酸的转运蛋白,同时也具备L-丝氨酸的转运能力。在谷氨酸棒杆菌?SSAAI中增强表达ThrE后,发现L-丝氨酸产量没有显著提高。进一步敲除ThrE,对L-丝氨酸产量影响也不显著。表明ThrE不是菌株?SSAAI中L-丝氨酸的主要转运蛋白,在菌株?SSAAI中存在其它L-丝氨酸转运蛋白。(2)利用比较基因组学的信息探究差异基因对L-丝氨酸转运的影响。前期基因组测序及比较基因组学的分析结果表明,SD36_RS14680、SD36_RS02065、SD36_RS15070、SD36_RS14970四个基因编码的蛋白可能与L-丝氨酸转运相关。在菌株?SSAAI中分别敲除这四个基因,结果表明敲除重组菌积累的L-丝氨酸与对照菌株相比没有显著差异,表明这四个基因编码的蛋白并没有转运L-丝氨酸的功能。(3)通过基因序列比对挖掘新的L-丝氨酸转运蛋白。文献报道大肠杆菌中L-半胱氨酸的转运蛋白EamA具有转运L-丝氨酸的功能。为了挖掘新的L-丝氨酸转运蛋白,经基因序列比对发现谷氨酸棒杆菌中存在三个eamA的同源基因:NCgl2065,NCgl2050,NCgl0580。进一步敲除NCgl2065,NCgl2050,NCgl0580,研究它们对菌株?SSAAI积累L-丝氨酸的影响。结果表明单独敲除基因NCgl2065、NCgl2050不影响菌株?SSAAI的L-丝氨酸产量,而敲除NCgl0580,重组菌?SSAAI?N0580的L-丝氨酸产量与对照菌相比下降60%,表明NCgl0580编码的蛋白可能具有转运L-丝氨酸的功能。(4)对基因NCgl0580进行功能与应用研究。通过回补实验研究发现,质粒回补NCgl0580能恢复菌株?SSAAI?N0580 L-丝氨酸生产能力。采用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告蛋白对NCgl0580编码的蛋白进行细胞定位研究,结果表明NCgl0580编码的蛋白定位在细胞膜上。结合底物转运实验证明NCgl0580编码的蛋白是新的L-丝氨酸转运蛋白。增强表达NCgl0580构建重组菌?SSAAI-N0580,其L-丝氨酸的积累达到28.67 g/L,较对照菌?SSAAI提高了10.5%。(5)对NCgl0580进行表达调控研究。在NCgl0580上游的存在一个反向转录基因NCgl0581,编码的蛋白为LysR家族转录因子。为了探究NCgl0581是否调控NCgl0580的表达,构建了基因NCgl0581敲除的重组菌?SSAAI?N0581,其L-丝氨酸产量下降57.4%。并结合探针质粒荧光表达实验,证实NCgl0581对NCgl0580的表达具有正调控作用。这为进一步探究L-丝氨酸转运蛋白表达调控机制奠定基础。