【摘 要】
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目的:构建并鉴定Ang2基因的RNA干扰慢病毒表达载体,为进一步进行体外肿瘤细胞的干预实验和对裸鼠移植瘤的抑制实验奠定基础。方法:1、以Ang2的mRNA已知序列为靶点,构建pSilencer1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒2条,并通过限制性内切酶HindIII酶切电泳及测序鉴定;2、将pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒经限制性内切酶XbaⅠ酶切电泳鉴定后,与
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目的:构建并鉴定Ang2基因的RNA干扰慢病毒表达载体,为进一步进行体外肿瘤细胞的干预实验和对裸鼠移植瘤的抑制实验奠定基础。方法:1、以Ang2的mRNA已知序列为靶点,构建pSilencer1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒2条,并通过限制性内切酶HindIII酶切电泳及测序鉴定;2、将pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒经限制性内切酶XbaⅠ酶切电泳鉴定后,与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pNL-EGFP载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒,并通过限制性内切酶XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定;3、用pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度以备后续实验使用。结果:1、成功构建pSilencer1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒2条,并且应用限制性内切酶HindIII进行消化,证实重组质粒不能被消化,测序结果与设计的完全相符;2、成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,并且通过限制性内切酶XbaⅠ酶切及测序鉴定,结果与预期完全相符;3、利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9*103/ul。结论:成功构建了Ang2基因的RNA干扰慢病毒表达载体,为进一步研究其对血管生成的作用打下了基础。
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